5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的相關性研究

周浩，魏守超，趙興軍，劉芳，劉志輝

動脈粥樣硬化是缺血性血管事件的高危因素，其所致動脈管腔狹窄及斑塊脫落所致的血流動力學異常可使腦組織供血區低灌注進而缺血缺氧壞死[1]。以往研究顯示，高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥與5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因677位上堿基C突變為堿基T有關。Hcy代謝相關酶MTHFR基因突變可通過升高Hcy導致動脈粥樣硬化的發生[2-3]。本研究旨在探究MTHFR基因多態性與前循環腦梗死患者頸動脈動脈粥樣硬化斑塊及其穩定性的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集濰坊醫學院附屬醫院神經內科2015年6月-2016年6月住院的新發前循環腦梗死患者，選擇同期無腦梗死的門診體檢者作為對照組。本研究經過濰坊醫學院附屬醫院倫理委員會批準。

入組標準：①新發前循環腦梗死，發病2周內，腦梗死符合《中國急性缺血性卒中診治指南（2014版）》診斷標準[4]；②根據急性卒中治療低分子肝素試驗（Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型[5]為大動脈粥樣硬化性腦梗死；③年齡＞18歲；④完成頸部血管超聲檢查；⑤患者及家屬知情同意。

排除標準：①慢性胃腸道疾病、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、惡性貧血、腫瘤、補充葉酸等對血漿中Hcy水平有影響的因素；②資料不全、中途退出、拒絕參加的患者。

1.2 分組及比較方法 比較腦梗死組與對照組的一般資料、血管危險因素、MTHFRC677T基因型及基因頻率分布；將腦梗死組按照頸動脈粥樣硬化斑塊性質分為穩定斑塊組和不穩定斑塊組，比較兩組MTHFRC677T基因型及基因頻率分布。進一步分析腦梗死組中MTHFRC677T基因多態性與頸動脈狹窄程度的相關性。

1.3 一般資料收集 記錄所有研究對象的性別、年齡、高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史。所有入組者清晨空腹取肘靜脈血，采用Olympus 87全自動生化分析儀檢測血漿Hcy水平和血脂水平。Hcy≥15 μmol/L，為高Hcy血癥。高脂血癥各項指標的定義為[6]：總膽固醇＞5.7 mmol/L、甘油三酯＞1.7 mmol/L、低密度脂蛋白膽固醇＞3.3 mmol/L；滿足其中一條即可診斷為高脂血癥。

1.4 雙側頸內動脈顱外段超聲檢測 采用西門子2000（探頭型號：9L4Multi-D，頻率：9MHz）血管超聲多普勒儀器，分別觀察入組者雙側頸總動脈起始部、主干及分叉部血管內膜有無動脈粥樣硬化斑塊及斑塊性質。

頸內動脈粥樣硬化斑塊及性質的確認[7]：在頸動脈竇以下1 cm處測量內膜中膜厚度。按照內膜中膜厚度＞1.3 mm判斷為頸動脈粥樣硬化斑塊形成。根據斑塊回聲強度分為：Ⅰ級低回聲脂質型斑塊，Ⅱ級等回聲纖維型斑塊，Ⅲ級強回聲或伴聲影的鈣化型斑塊，Ⅳ級回聲強弱不均的潰瘍型混合斑塊。Ⅰ、Ⅳ級為不穩定斑塊組；Ⅱ、Ⅲ級為穩定斑塊組。有兩處或兩處以上斑塊且性質不同以病變程度較重處為準。

頸動脈狹窄程度的分型[8]：①輕度狹窄，狹窄率＜50%，灰階圖像顯示局部斑塊形成，管徑相對減小，血流無明顯變化。②中度狹窄，狹窄率為50%～69%，狹窄段血流出現加速度，狹窄遠段病理性渦流形成。③重度狹窄，狹窄率為70%～99%，狹窄段流速進一步升高，狹窄近段流速相對減低，遠段出現渦流和湍流混雜的血流信號。④血管閉塞，血流信號消失，無血流通過。若存在兩處及兩處以上的狹窄，以程度重者為準。

1.5MTHFRC677T基因多態性檢測 樣本脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的制備：采集靜脈血1 ml，加至抗凝管中，用血液基因組DNA提取試劑盒提取和純化DNA。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：將MTHFR擴增液分裝到0.2 ml薄壁管中做好標記，根據要檢測的樣本數，選取等量的擴增管，在各擴增管中分別加入1.0 μl的反應液[（Thermus Aquaticus enzyme，Taq）酶、尿嘧啶-N-糖基化（uracil-N-glycosylase，UNG）酶]；在各擴增管中加入2 μl提取好的樣品DNA溶液，混勻。然后將各管放入PCR儀中進行擴增，擴增后產物在2～8℃保存。

雜交顯色和結果分析：將MTHFR基因芯片放入雜交儀片架中，吸取190 μl雜交緩沖液，加入10 μl PCR擴增產物，混勻制成雜交反應液，加入試管中，放入雜交儀運行雜交程序；反應結束后，取出芯片，將芯片放入生物芯片識讀儀中用基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描和數據分析。

基因亞型的判斷：MTHFR3種基因型：677CC，677CT和677TT。其中677CC為MTHFR酶222位丙氨酸純合子，酶活性正常；677CT為MTHFR酶222位丙氨酸/纈氨酸雜合子，酶活性居中；677TT為MTHFR酶222位纈氨酸純合子，與677CC酶活性相比降低50%～60%。

1.6 統計學方法 應用SPSS 11.5軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，用表示，兩組間比較采用t檢驗。計數資料用率表示，兩組間比較用χ2檢驗。MTHFR基因多態性與頸動脈狹窄程度的相關性用Spearman等級相關檢驗。腦梗死患者多因素分析采用Logistic回歸模型，以頸動脈粥樣硬化斑塊為因變量，以性別、年齡、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、高血壓病、MTHFR基因C677T多態性為自變量，計算自變量的比值比（odds ratio，OR）和95%可信區間（confidence interval，CI）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 腦梗死組150例，其中男85例，女65例，平均（63.93±7.56）歲。對照組100例，其中男55例，女45例，平均（64.63±7.16）歲。腦梗死組與對照組性別、年齡、吸煙、飲酒、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病病史等方面均無顯著性差異，腦梗死組的高Hcy血癥、高血壓、高脂血癥發病率顯著高于對照組（表1）。

表1 兩組一般危險因素比較

2.2 腦梗死組與對照組MTHFRC677T基因型及基因頻率分布 腦梗死組MTHFRC677T突變（TT）基因型和T等位基因頻率均顯著高于對照組（分別χ2=22.067，P＜0.001；χ2=6.907，P=0.009）（表2）。

表2 腦梗死組與對照組基因多態性比較

2.3 腦梗死組中MTHFRC677T基因多態性與頸動脈狹窄程度的相關性 腦梗死組CC基因型30例，其中頸動脈無狹窄16例（53.3%），輕度狹窄9例（30.0%），中重度狹窄5例（16.7%）；CT基因型48例，其中頸動脈無狹窄9例（18.8%），輕度狹窄16例（33.3%），中重度狹窄23例（47.9%）；TT基因型組72例，其中無狹窄10例（13.9%），輕度狹窄24例（33.3%），中重度狹窄38例（52.8%）。腦梗死患者MTHFR C677TC→T基因突變與頸動脈狹窄程度呈正相關（r=0.353，P＜0.001）。

2.4 腦梗死組不穩定斑塊組與穩定斑塊組MTHFRC677T基因型及等位基因頻率分布 腦梗死患者中不穩定斑塊組71例，穩定斑塊組44例，不穩定斑塊組MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率均顯著高于穩定斑塊組（分別是χ2=14.587，P＜0.001；χ2=6.978，P=0.008）（表3）。

表3 腦梗死患者穩定斑塊組與不穩定斑塊組間MTHFR C677T基因多態性比較

2.5 腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成危險因素多因素分析 將腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成為因變量，性別、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、MTHFR基因C677T多態性、高脂血癥和高Hcy血癥等腦梗死危險因素納入Logistic回歸方程。結果顯示：性別、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、MTHFR基因C677T多態性、高脂血癥和高Hcy血癥均是頸動脈粥樣硬化斑塊形成的危險因素。以C/C基因型為對照，C/T（P=0.001）、T/T（P=0.009）基因型均增加頸動脈粥樣硬化斑塊形成的機會（表4）。

3 討論

既往研究發現MTHFR是Hcy代謝的關鍵酶之一，其存在三種基因型，分別是677CC（正常基因型），677TT（純合子突變基因型）和677CT（雜合子突變基因型）。編碼此酶的基因突變是造成Hcy水平增高及增加動脈粥樣硬化和斑塊不穩定性的高危因素[9]。MTHFR基因突變可導致MTHFR活性明顯下降，引起Hcy升高[10]。Hcy可損傷內皮細胞、促進平滑肌細胞的增殖、改變血液系統的抗凝狀態及血小板功能，參與動脈粥樣硬化的發生發展過程[11-13]。

目前，MTHFRC677T基因多態性是否與頸動脈粥樣硬化相關仍存在著爭議。有研究發現，MTHFRC677T等位基因在動脈內彈力層斷裂中起一定作用，后者可使平滑肌細胞遷移到內膜中，是早期動脈粥樣硬化性器官損害發生發展的獨立危險因素[14]。但也有研究者認為MTHFRC677T基因突變雖然可以引起Hcy水平升高，但與動脈粥樣硬化并無顯著相關性[15]。

表4 頸動脈粥樣硬化斑塊形成相關危險因素分析

在本研究中，前循環大動脈粥樣硬化性腦梗死患者MTHFRC677T突變（TT）基因型和T等位基因頻率均顯著高于對照組，提示MTHFR的T等位基因頻率可能是腦梗死的危險因素。進一步分析顯示腦梗死患者MTHFRC677TC→T基因突變與頸動脈狹窄程度正相關，表明MTHFR的T等位基因頻率與腦梗死患者頸動脈狹窄程度有關，可能是腦梗死患者頸動脈狹窄的危險因素。劉斌等研究顯示[16]，腦梗死組MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率顯著高于對照組，此外，MTHFR的T等位基因頻率與腦梗死患者頸動脈狹窄及其程度有關，與本文研究結果一致。

頸動脈粥樣硬化斑塊的性質與腦梗死的發生密切相關。有研究顯示，導致動脈粥樣硬化斑塊不穩定的內因主要是由于纖維帽厚度、偏心脂質核心大小和堅固性，易于破裂的斑塊與纖維帽的細胞外基質膠原的積累和彈性纖維成分的減少[17-19]。本研究顯示，腦梗死組中不穩定斑塊組MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率高于穩定斑塊組，表明MTHFRC677T突變（TT）基因型及T等位基因頻率是腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊不穩定性的高危因素。

以往研究發現[20-21]，補充葉酸可能減輕Hcy對血管的損害，本研究未分析葉酸對患者Hcy水平及頸動脈粥樣硬化斑塊的影響，后續研究需要完善相關數據。本研究以超聲對動脈狹窄進行判斷，其準確性低于血管影像學檢查，而且操作者之間的不一致性也很難避免；另外，本研究中腦梗死組不是連續入組，可能會對結果造成一定的偏倚。

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