肺炎支原體莢膜多糖抑制樹突狀細(xì)胞吞噬和膜分子表達(dá)①

陳春艷 劉紫玲 余 斕 陳列松 曾燚華 游曉星 朱翠明

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽 421001)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是兒童呼吸道感染常見的病原體，主要引起支原體肺炎、氣管炎、支氣管炎等，并與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)[1- 3]。Mp無細(xì)胞壁，其侵入機(jī)體后主要通過細(xì)胞膜上的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白和菌體外的莢膜多糖(Capsular polysaccharides,CPS)與宿主細(xì)胞相互作用。目前國內(nèi)外對(duì)Mp致病機(jī)制的研究主要集中在脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白[4- 6]，對(duì)CPS的研究較少。在Mp感染致病的過程中，CPS除了抗吞噬和抵抗有害物質(zhì)的損傷外，是否還有其他的功能？目前尚不清楚。

樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子- 3- 結(jié)合非整合素分子(Dendritic cell- specific intercellular adhesion molecule- 3- grabbing nonintegrin，DC- SIGN)是一種模式識(shí)別受體和黏附受體，主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)表面。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多病原菌，如肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌、人類免疫缺陷病毒、利什曼原蟲等均能與DC- SIGN結(jié)合，激活后續(xù)信號(hào)通路，使病原體逃避宿主的免疫防御，導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染[7- 10]。

我們前期發(fā)現(xiàn)Mp 的CPS也是DC- SIGN的病原相關(guān)模式分子[11]。本實(shí)驗(yàn)擬初步研究CPS對(duì)DC吞噬功能和表達(dá)膜分子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 Mp菌株(Strain M129,ATCC 29342)。CM403培養(yǎng)基(Oxoid)；Phase Lock Gel Light購自天根生化科技有限公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津TBD 公司；鼠抗DC- SIGN特異性抗體(Novus Biologicals)；重組人GM- CSF和IL- 4(R&D)。APC- Mouse Anti- Human CD11c、PE Mouse Anti- Human CD80、PerCP- CyTM5.5 Mouse Anti- Human HLA- DR、APC Mouse Anti- Human CD83、FITC Mouse Anti- Human CD86均為BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1Mp CPS的提取 培養(yǎng)Mp M129菌株，4℃ 12 000 r/min離心20 min收集菌體。按文獻(xiàn)[12]抽提CPS。方法如下：將1 L Mp離心后收集的沉淀用含10%葡萄糖的PBS洗滌2次后重懸于10 ml洗滌液中，加入等體積苯酚混勻，60℃孵育30 min，6 000 r/min離心30 min后移取水相和交界面，重復(fù)離心至液體澄清。將其透析過夜后在透析液中加入100 μg RNAase A和40 U DNAase Ⅰ、Ⅱ，37℃靜置18 h。再加入5 g/L SDS和100 μl 蛋白酶K，45℃孵育 24 h。在透析液中加等體積的苯酚/氯仿混合物，混勻后移至含phase- lock gel的離心管離心，吸取水相，加入等體積氯仿后再次離心，取上清，用蒸餾水透析 4 d。在透析液中加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和4倍體積無水乙醇，離心棄上清，沉淀(即為抽提的CPS)用100 μl滅菌蒸餾水溶解，苯酚硫酸法定量，置-70℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前用PBS稀釋至相應(yīng)濃度。

1.2.2外周血單核細(xì)胞來源的DC的培養(yǎng) 將20 ml 健康人靜脈血用等量D- Hank′s液稀釋。用密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，分離的細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，2 mmol/L L- 谷氨酰胺,20 ng/ml重組人IL- 4,10 ng/ml 重組人GM- CSF)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106ml-1，將其加入皮氏培養(yǎng)皿，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，隔天半量換液。培養(yǎng)至第6天后，將皮氏培養(yǎng)皿中細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜(以去除貼壁的巨噬細(xì)胞)，收集培養(yǎng)7 d的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106ml-1，將其轉(zhuǎn)至24孔板，每孔0.5 ml。細(xì)胞用吉姆薩染色后顯微鏡觀察形態(tài)，并以APC mouse anti- Human CD11c抗體染色，F(xiàn)CM檢測DC純度。

1.2.3iDC吞噬功能檢測 實(shí)驗(yàn)共分四組：①15 μg/ml CPS刺激培養(yǎng)7 d的DC；②15 μg/ml CPS 刺激DC- SIGN單抗(1∶100)預(yù)處理30 min后的DC；③DC- SIGN單抗(1∶100)刺激的DC;④PBS處理的DC。分組刺激DC 24 h，1 000 r/min離心10 min 收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。用1 ml含5%胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，加入終濃度為1 mg/ml的FITC- 多聚糖，37℃孵育30 min。細(xì)胞用預(yù)冷的FACS緩沖液洗滌2次，F(xiàn)CM檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.4DC表面膜分子檢測 實(shí)驗(yàn)分組和處理同1.2.3。24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的FACS緩沖液洗滌2次。分裝，每管100 μl。用流式抗體APC- CD83、PerCR- cy5.5- HLA- DR、PE- CD80和FITC- CD86及其相對(duì)應(yīng)的同型抗體染色，4℃孵育30 min。用預(yù)冷的FACS緩沖液1 200 r/min離心5 min洗滌細(xì)胞，重復(fù)2次。棄上清，每管加入300 μl FACS緩沖液，F(xiàn)CM檢測DC表面膜分子的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 DC細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，大部分呈克隆集落狀，可見樹突狀突起(圖1)。FCM檢測分離培養(yǎng)出的DC表面CD11c分子的陽性率為86.27%。

2.2CPS對(duì)DC吞噬功能的影響 用CPS刺激DC，F(xiàn)CM分析DC吞噬的FITC- 多聚糖平均熒光強(qiáng)度，檢測DC的吞噬功能。結(jié)果顯示CPS刺激組DC 較對(duì)照組DC吞噬的FITC- 多聚糖平均熒光強(qiáng)度顯著增加(P<0.05)。若用DC- SIGN單抗預(yù)先封閉30 min，再用CPS刺激DC，細(xì)胞內(nèi)FITC- 多聚糖平均熒光強(qiáng)度較DC- SIGN未封閉組DC顯著降低(P<0.05)，且與對(duì)照組DC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、3。

圖1 人外周血PBMC來源的DC吉姆薩染色觀察(×400)Fig.1 Dendritic cells derived from human peripheral blood mononuclear cells(Giemsa staining,×400)

圖2 不同處理組DC吞噬能力的流式檢測結(jié)果Fig.2 FCM detect phagocytosis of DC under differ- ent treatments

圖3 不同處理組DC吞噬FITC- 多聚糖的熒光平均值(n=3)Fig.3 Fluorescence means of FITC- dextran uptake by DC with different treatments(n=3)

2.3CPS刺激對(duì)DC表面膜分子的影響 培養(yǎng)7 d的DC用CPS刺激，F(xiàn)CM檢測DC表面膜分子CD83、HLA- DR、CD80和CD86表達(dá)水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照理組DC相比，CPS刺激組DC表面四種膜分子陽性百分率均顯著下降(P<0.05)。用DC- SIGN封閉抗體預(yù)先處理后，再用CPS刺激DC，其表面四種膜分子的表達(dá)較CPS處理組DC顯著降低(P<0.05)，與PBS處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、5。

圖4 FCM分析不同處理組DC 四種膜表面分子表達(dá)Fig.4 FCM analyzed expression of CD83,HLA- DR,CD80 and CD86 on different treated DC

圖5 不同處理組四種膜表面分子的表達(dá)(n=3)Fig.5 Expression of CD83,HLA- DR,CD80 and CD86 on different treated DC(n=3)Note: *.P<0.05.

3 討論

DC 是功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞，表達(dá)多種膜分子，其中CD83是DC標(biāo)志性分子，主要表達(dá)于成熟DC；HLA- DR屬HLA- Ⅱ類分子，可輔助DC提呈抗原；CD80(B7- 1)和CD86(B7- 2)是DC細(xì)胞活化的協(xié)同刺激分子，作為第二信使激活初始T細(xì)胞。未成熟DC主要分布在機(jī)體器官及非淋巴組織的上皮中，其Fc和甘露糖受體表達(dá)水平高，而HLA- Ⅱ類分子和協(xié)同刺激分子表達(dá)水平低，故未成熟DC攝取抗原的能力強(qiáng)，提呈抗原的能力弱；受抗原等刺激后，DC逐漸分化成熟，成熟DC表面CD83、MHCⅡ類分子、協(xié)同刺激分子等的表達(dá)顯著增高，而Fc受體等表達(dá)減少，故而成熟DC攝取抗原的能力降低，但提呈抗原的能力增強(qiáng)[13- 15]。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用CPS刺激DC后，其吞噬功能顯著增強(qiáng)，但CD83、HLA- DR、CD80和CD86的表達(dá)水平降低，這表明CPS可抑制體外培養(yǎng)DC的自然成熟。用單抗預(yù)先封閉DC- SIGN后再用CPS刺激DC，其吞噬功能和四種膜分子的表達(dá)水平與對(duì)照組相比無顯著改變，這些結(jié)果說明，CPS抑制DC成熟是通過結(jié)合DC- SIGN發(fā)揮作用。

Mp是一種胞外寄生菌，其感染機(jī)體后，黏附在呼吸道上皮細(xì)胞表面生長繁殖，產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物致病。但研究顯示，Mp亦可通過其頂端結(jié)構(gòu)侵入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)合成DNA并生長繁殖，并能在感染宿主細(xì)胞內(nèi)長期存活，引起慢性持續(xù)性感染[16,17]，其胞內(nèi)兼性寄生機(jī)制目前尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CPS通過DC- SIGN可抑制DC成熟，從而抑制DC將Mp抗原提呈給初始T細(xì)胞，減弱特異性免疫應(yīng)答。此外Mp的CPS與DC- SIGN結(jié)合可促進(jìn)IL- 10的分泌，故CPS激活的DC- SIGN信號(hào)通路可能與Mp在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)性感染有關(guān)[11]。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)Mp的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白與DC表面的Toll樣受體結(jié)合后，能促進(jìn)其表達(dá)CD83、HLA- DR、CD80和CD86分子[18]。DC- SIGN和Toll樣受體兩條通路之間存在串話[19- 20]，Mp CPS激活的DC- SIGN信號(hào)通路和脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白激活的Toll樣受體通路之間是否也存在串話？還有待于進(jìn)一步研究。

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