雙歧桿菌聯合烏司他丁對膿毒癥模型大鼠免疫功能的影響①

王麗輝 申亞暉 郭艷青 孫治霞 邵煥璋

(河南省中醫院重癥醫學科,鄭州 450002)

膿毒癥是由于病原微生物所致的全身炎性反應綜合征，涉及體內多個器官和系統，發病機制復雜，若早期得不到有效治療，會發展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，病死率高達70%[1]。研究表明，免疫功能紊亂、腸屏障損傷導致的腸源性感染是MODS發生的重要原因之一，在膿毒癥發病機制中起重要作用[2- 4]。烏司他丁通過穩定溶酶體膜、抑制水解酶活性，發揮抗炎、抗休克作用，臨床上常用于緩解膿毒癥患者器官功能衰竭，增強免疫功能[5]。另有研究表明，烏司他丁能通過保護組織器官和內皮細胞，抑制多形核白細胞彈性蛋白酶、腫瘤壞死因子(TNF- α)、促炎細胞因子和白細胞介素(IL- 1、IL- 6、IL- 8)水平，減輕膿毒癥損傷[6,7]。雙歧桿菌為專性厭氧菌，是腸道內的優勢菌群，可在腸道內產生乳酸、醋酸等有機酸及細菌素等抑菌物質，有助于提高機體的免疫能力[8- 10]。研究表明，雙歧桿菌能夠減輕膿毒癥引起的肺損傷和炎癥反應[11]。長雙歧桿菌是雙歧桿菌的一種，可以直接補充腸道有益菌，調整腸道菌群失調。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，觀察腹腔注射雙歧桿菌聯合烏司他丁后動物模型生存率、TNF- α、IL- 6含量、腸道菌群、血漿內毒素和T淋巴細胞亞群的變化，以探索雙歧桿菌聯合和烏司他丁對膿毒癥的治療效果，為臨床上對膿毒癥的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 潔凈級成年SD大鼠100只，雄性，體重200～250 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，實驗前適應性喂養7 d。

1.1.2試劑 長雙歧桿菌B.adolescentis(由中科院微生物研究所提供)；烏司他丁(廣東天普生化醫藥股份有限公司)；TNF- α、IL- 6 ELISA試劑盒(Biolegend公司)；鱟試劑(TAL,廈門市鱟試劑實驗廠有限公司)；氯胺酮(廣東嘉博制藥有限公司)；乙二胺四乙酸(EDTA,石家莊杰克化工有限公司)；水為超純水。

1.2方法

1.2.1膿毒癥動物模型的建立 采用盲腸結扎穿孔術(Cecal ligation and puncture,CLP)[12]，大鼠禁食12 h后，腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，放置于操作臺上，于腹正中作約1.5 cm切口，分離盲腸組織，用手術縫線從根部結扎末端1/2盲腸，用針頭于盲腸上穿通2次形成盲腸漏，留置一條7號絲線防止針孔閉合，1號絲線關閉腹腔，術后立即皮下注射生理鹽水(10 ml/kg)抗休克。

1.2.2動物分組與給藥 把100只雄性SD大鼠，按隨機數字表法分為假手術組、模型組、雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯合治療組，每組20只。假手術組開腹找到盲腸后立即關腹，不結扎，不穿孔盲腸；模型組按照“1.2.1”中方法處理，使大鼠發生腹腔感染繼而出現膿毒癥；雙歧桿菌治療組在模型組的基礎上，每12 h腹腔注射雙歧桿菌(250 mg/kg)；烏司他丁治療組在模型組的基礎上，每12 h腹腔注射烏司他丁(1 000 U/100 g)；聯合治療組在模型組的基礎上，每12 h腹腔注射雙歧桿菌后給予烏司他丁治療。

1.2.3觀察記錄生存數 觀察各組大鼠的生存情況，記錄小鼠生存數量。

1.2.4檢測腸道菌群 造模48 h后無菌收集大鼠糞便約0.1 g，加0.9 ml稀釋液于無菌青霉素瓶中混勻，稀釋后分別接種于各個培養基中，經張秀榮[13]菌落特征、革蘭氏染色、鏡檢等初步鑒定后計數，計算出每克糞便中大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌的數量。

1.2.5血樣的采集與檢測 于術后48 h收集血液，加入EDTA抗凝血管中，靜置15 min，置于4℃下3 000 r/min離心機離心15 min，取上清液于-80℃冰箱保存。采用ELISA法測定TNF- α、IL- 6水平，操作方法嚴格按照試劑盒所附說明書進行。鱟試劑法測定血漿內毒素水平。用流式細胞術檢測血漿T細胞亞群。

2 結果

2.1生存率的計算 模型組的生存率顯著低于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯合治療組大鼠的生存率顯著升高(P<0.05)，聯合治療組大鼠的生存率顯著優于雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組 (P<0.05)。見表1。

2.2腸道菌群 模型組中大腸桿菌的含量顯著高于假手術組，雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量顯著低于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯合治療組的大腸桿菌的含量顯著降低(P<0.05)，聯合治療組的療效顯著優于雙歧桿菌治療組；與模型組比較，雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量顯著增高(P<0.05)，聯合治療組的療效顯著優于烏司他丁治療組(P<0.05)。見表2。

表1各組大鼠48h生存率比較

Tab.1Comparisonof48hsurvivalrateinratsofvariousgroups

GroupsnnsurvivalSurvivalrate(%)Shamoperatedgroup2020 100Modelgroup206 301)Bifidobacteriumtreatmentgroup2010 502)3)Ulinastatintreatmentgroup2011 552)3)Combiningtreatmentgroup2015 752)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

2.3TNF- α、IL- 6水平 模型組大鼠TNF- α、IL- 6水平顯著高于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯合治療組的TNF- α、IL- 6水平顯著降低(P<0.05)，聯合治療組的療效顯著優于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表3。

2.4血漿內毒素水平 模型組大鼠內毒素水平顯著升高，與假手術組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯合治療組的血漿內毒素水平顯著降低(P<0.05)，聯合治療組的療效顯著優于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表4。

2.5T淋巴細胞亞群 模型組大鼠CD3+、CD4+T細胞、CD4+/CD8+T細胞比值顯著下降，CD8+T顯著上升，與假手術組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌治療組、烏司他丁治療組、聯合治療組的CD3+、CD4+T細胞、CD4+/CD8+T細胞比值顯著升高，CD8+T顯著下降(P<0.05)。聯合治療組的療效顯著優于雙歧桿菌治療組和烏司他丁治療組(P<0.05)。見表5。

表2各組大鼠腸道菌群數量比較

Tab.2Comparisonofintestinalflorasinratsofvariousgroups

GroupsnEscherichiaColi(IgN/g)Lactobacillus(IgN/g)Bifidobacterium(IgN/g)Shamoperatedgroup206.56±0.448.7±0.6510.01±0.41Modelgroup613.54±0.391)1.32±0.211)2.52±0.281)Bifidobacteriumtreatmentgroup107.48±0.292)5.45±0.312)3)8.61±0.462)Ulinastatintreatmentgroup119.61±0.892)3)4.80±0.392)3)6.34±0.292)3)Combiningtreatmentgroup157.31±0.422)7.71±0.602)9.27±0.432)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

表3CLP大鼠TNF-α、IL-6含量比較

Tab.3ComparisonofTNF-αandIL-6inratsofvariousgroups

GroupsnTNF-α(ng/ml)IL-6(pg/ml)Shamoperatedgroup208.26±0.7614.09±1.41Modelgroup635.70±2.011)41.10±2.151)Bifidobacteriumtreatmentgroup1017.72±1.502)24.17±1.912)3)Ulinastatintreatmentgroup1113.76±1.632)20.28±0.982)3)Combiningtreatmentgroup159.94±1.212)16.99±1.422)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

表4各組大鼠血漿內毒素水平比較

Tab.4Comparisonofserumendotoxininratsofvariousgroups

GroupsnPlasmaendotoxinlevel(EU/ml)Shamoperatedgroup200.169±0.068Modelgroup60.287±0.0191)Bifidobacteriumtreatmentgroup100.239±0.0152)3)Ulinastatintreatmentgroup110.211±0.0262)3)Combiningtreatmentgroup150.185±0.0212)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

表5CLP大鼠T淋巴細胞亞群變化比較

Tab.5ComparisonofT-lymphocytesubsetsinratsofvariousgroups

GroupsnCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+Shamoperatedgroup2066.66±1.4944.40±0.9324.50±0.501.81±0.04Modelgroup655.20±0.851)31.10±0.821)26.00±0.701)1.19±0.021)Bifidobacteriumtreatmentgroup1060.97±1.972)39.59±0.942)25.40±0.491.56±0.032)3)Ulinastatintreatmentgroup1164.01±1.102)41.35±0.822)24.50±0.282)1.69±0.042)3)Combiningtreatmentgroup1566.21±1.122)44.87±0.912)24.59±0.542)1.82±0.022)

Note：Compared with sham operated group,1)P<0.05; compared with model group,2)P<0.05; compared with combining treatment group,3)P<0.05.

3 討論

膿毒癥的免疫調節機制十分復雜，目前臨床上采用烏司他丁等藥物提高機體的免疫能力是膿毒癥治療的主要治療手段。正常情況下，大鼠腸道菌群之間保持著平衡的比例關系，且厭氧菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)數量高于需氧菌(大腸桿菌)數量。本研究利用雙歧桿菌對腸道菌群的調節提高免疫的作用，聯合烏司他丁探究其對膿毒癥動物模型免疫功能的影響。結果表明，膿毒癥大鼠模型中厭氧菌雙歧桿菌及乳酸桿菌數量明顯減少，需氧菌大腸桿菌數量增加，腸道菌群發生紊亂，腸道菌群的數量和比例菌發生了改變。治療組中，雙歧桿菌治療對腸道菌群的調節能力明顯高于烏司他丁組，說明雙歧桿菌能夠調節腸道菌群平衡，防止腸道菌群紊亂，促進構成腸黏膜的微生物屏障，阻止致病菌的入侵，與文獻報道結果相符[14]。

TNF- α、IL- 6是早期促炎細胞因子，參與早期膿毒癥并發多器官損傷，能通過促進自由基、緩激肽、組胺等物質的產生，激活補體等，加重組織損傷[15]。腸道益生菌可誘導淋巴細胞因子表達，下調炎性因子，促進上皮細胞肌動蛋白和咬合蛋白磷酸化，加強上皮間的緊密連接，從而抑制病原對黏膜的損害，保持黏膜的完整性[16]。模型組中TNF- α、IL- 6水平大幅度增加，說明膿毒癥引起了機體的炎癥反應，此反應能通過雙歧桿菌、烏司他丁治療有效緩解，烏司他丁比雙歧桿菌抗炎作用更明顯，二者聯合使用可以更好地提高療效。

T淋巴細胞亞群可以反映出機體的免疫功能，模型組中CD3+、CD4+T細胞顯著減少，說明膿毒癥對機體產生了免疫抑制作用，治療組中CD3+、CD4+T細胞顯著升高，說明雙歧桿菌與烏司他丁對膿毒癥模型大鼠的免疫功能起促進作用。本研究通過建立膿毒癥動物模型，確定了雙歧桿菌聯合烏司他丁較單用烏司他丁可更有效地降低膿毒癥大鼠的死亡率，抑制膿毒癥大鼠的炎癥因子，調節腸道菌群，降低血漿內毒素，提高機體免疫能力。雙歧桿菌通過調節腸道菌群平衡，對烏司他丁的療效起促進作用。

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