IL- 17參與巨細胞病毒肝炎致病機制的研究①

劉玲玲 黃 媛 馬 迪 廖 毅 劉興樓 李 革 舒賽男 方 峰

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科病毒實驗室，武漢 430030)

人類巨細胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)屬于皰疹病毒β亞科，是一種dsDNA病毒，具有與其他皰疹病毒類似的潛伏- 活化及持續感染的特性。但其致病力較弱，是一種機會性致病原。主要對免疫力低下(如新生兒、嬰幼兒)、免疫抑制(如器官移植患者等)和免疫缺陷(如艾滋病患者)的人群造成危害。肝臟是最易受累的器官，感染者約60%～80%出現肝臟損傷，表現為肝脾大、黃疸及肝功能受損[1- 3]。

肝臟是CMV感染的主要靶器官，不僅在全身播散性感染時容易受累，還是主要受累的單個器官之一。臨床上，巨細胞病毒性肝炎可表現為黃疸型或無黃疸型肝炎，常有輕～中度肝腫大伴血清肝酶輕～中度升高，常伴脾大，可伴不同程度膽汁淤積。炎性因子IL- 17，是Th17細胞主要的效應分子，其過高表達與多種疾病密切相關，其中，肝臟疾病包括自身免疫性肝病、急性肝損傷、慢性病毒性肝病及肝細胞癌等。近年來的研究發現，慢性乙型肝炎患者外周血中Th17細胞的數量及其分泌IL- 17的量都顯著上調，與ALT升高顯著相關，并參與膽管的慢性炎癥過程，介導肝纖維化的形成[4,5]。研究顯示IL- 17在巨細胞病毒性肝炎中也發揮著重要的作用，基于此，我們將在整體水平上對促炎因子IL- 17對巨細胞病毒肝炎中的致病機制進一步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 4周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級[合格證號：SCXK(鄂)2008- 0005]，購于湖北省醫學科學院實驗動物中心，飼養在同濟醫院動物室潔凈層柜內。實驗前適應性飼養3 d。

1.1.2病毒 MCMV Smith株(美國德克薩斯大學健康衛生中心惠贈)在BALB/c小鼠唾液腺中傳毒增殖，收獲病毒用于本實驗，經標準空斑試驗測定收獲病毒的平均感染性滴度為4.9×105PFU/ml。

1.1.3MCMV感染小鼠模型的建立及實驗分組 參考文獻[6,7]：①正常對照組：每只小鼠腹腔注射200 μl相同稀釋的正常唾液腺組織勻漿；②MCMV感染對照組：每只小鼠腹腔接種200 μl含5×103PFU MCMV唾液腺組織勻漿；③同型抗體阻斷對照組：每只小鼠腹腔注射200 μl含5×103PFU MCMV唾液腺組織勻漿，同時在感染后第3天、第5天腹腔注射同型抗體100 μg/只；④IL- 17抗體阻斷組：每只小鼠腹腔注射200 μl含 5×103PFU MCMV唾液腺組織勻漿，同時在感染后第3天、第5天腹腔注射100 μg/只的抗小鼠IL- 17抗體。在病毒感染后第7天收獲小鼠。

1.2方法

1.2.1用Western blot法檢測肝臟組織中IL- 17蛋白表達水平 提取肝臟組織蛋白，經蛋白裂解液裂解后應用BCA蛋白測定試劑盒測定裂解液上清中的蛋白濃度。各樣本取50 μg蛋白上樣，經電泳分離蛋白并轉至PVDF膜上。封閉液浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。兔抗鼠IL- 17(1∶1 000),β- actin(1∶500)稀釋，將已封閉的PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，排出氣泡，4℃孵育過夜。羊抗兔結合HRP的特異IgG二抗(1∶5 000)孵育后，用化學發光凝膠成像系統采集圖像，采用Quantity one 4.62軟件測定各蛋白光密度值，以β- actin條帶為內參進行蛋白上樣量的校正，以此對目的蛋白表達水平進行半定量分析。

1.2.2ELISA法檢測血清中IL- 17水平 采用雙抗體夾心ELISA法檢測試驗過程中小鼠血清中IL- 17水平。

1.2.3用HE染色法評估肝臟組織的病理性損傷程度 石蠟包埋肝臟組織切片行蘇木紫- 伊紅染色，并對其組織損傷進行評估。肝臟組織損傷標準根據Knodell肝組織病變活動性積分(Histological activity index,HAI)進行評估[8,9]。應用Olympus BX41顯微鏡攝像系統進行觀察，每個標本選擇3張切片，每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野(200×)進行觀察。

1.2.4RT- PCR法檢測肝臟組織內IL- 17R、IFN- γ和IL- 10基因轉錄(mRNA)水平 用Trizol法提取肝臟組織總的RNA，檢測RNA純度 為1.959～2.089；反轉錄嚴格按試劑盒(Thermo提供)操作，cDNA合成模板RNA取5 μg；PCR試劑盒由Fermentas提供，每份樣本同時檢測目的基因和內參GAPDH基因。引物序列如表1[10- 12]： PCR反應體系：樣本 cDNA 1 μl ，上、下游引物(pmol)各1 μl，共50 μl的反應體系。反應條件：IL- 17R與GAPDH:95℃預變性5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s，共36個循環。IFN- γ:95℃ 預變性5 min；95℃，30 s；57℃，30 s；72℃，30 s，共28個循環。IL- 10:95℃ 預變性5 min；95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s，共35個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描，Quantity One軟件分析其IL- 17R、IFN- γ和IL- 10與GAPDH的Volume(CNTx mm2)比值，即用相對比值來表示IL- 17R、IFN- γ和IL- 10 mRNA的表達量。

表1引物序列

Tab.1Primersequences

GenePrimersequencesbpIL-17RSense5'-CCACTCTGTAGCACCCCAATG-3'Antisense5'-CCTGGAGATGTAGCCCTGGTC-3'225IFN-γSense5'-TTTGAGGTCAACAACCCACA-3'Antisense5'-CGCAATCACAGTCTTGGCTA-3'388IL-10Sense5'-GAAAAGAGAGCTCCATCATGCCTGG-3'Antisense5'-GATTTAGAGAGCTCTGTCTAGGTCC-3'623GAPDHSense5'-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3'Antisense5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'151

1.2.5用羅氏生化分析儀檢測血清ALT水平 血清ALT水平由 DPPI羅氏生化分析儀檢測。

2 結果

2.1腹腔注射IL- 17抗體后組織內IL- 17表達 建立MCMV全身播散性感染模型后，通過腹腔注射IL- 17抗體中和其體內表達的IL- 17蛋白。采用Western blot檢測其在肝臟組織中IL- 17表達情況。肝臟組織結果顯示，IL- 17抗體阻斷組IL- 17表達量與MCMV感染對照組及同型抗體對照組比較明顯降低，差異具有統計學意義(圖1，P<0.05)，表明腹腔注射IL- 17抗體有效阻斷了肝臟組織中IL- 17的表達。

圖1 IL- 17抗體阻斷效應Fig.1 Blocked IL- 17 in vivoNote: 1.Control；2.MCMV infected mice；3.Anti- 17 mice；4.Isotype control.

圖2 各實驗組血清IL- 17水平測定Fig.2 Levels of IL- 17 in serumNote: *.P<0.05.

2.2血清中IL- 17水平 與同型抗體對照組及MCMV感染對照組相比，IL- 17抗體阻斷組的IL- 17 明顯減低(圖2)。

2.3肝臟組織病理評估 IL- 17抗體阻斷組在MCMV感染后第7天，體內中和IL- 17表達后，肝組織中炎性細胞浸潤明顯輕于MCMV感染組及同型抗體阻斷對照組，肝臟病理評分為(4.5±0.5)，而MCMV感染組和同型抗體阻斷組的肝組織病理評分分別為(7.3±0.8)、(7.1±0.8)。說明降低IL- 17表達可以有效減輕肝組織的炎性細胞浸潤，減輕肝損傷(圖3)。

2.4血清ALT變化 IL- 17阻斷組血清 ALT水平明顯低于MCMV感染對照組小鼠及同型抗體阻斷對照組小鼠(圖4，P<0.05)。提示阻斷體內IL- 17水平可以減輕巨細胞病毒感染所致肝損傷，促進肝功能的恢復。

2.5肝組織中IL- 17R、 IFN- γ及IL- 10mRNA的表達 在感染MCMV后阻斷體內炎性因子IL- 17表達，見IL- 17抗體阻斷組肝組織內IFN- γ表達量明顯高于MCMV感染組及同型抗體阻斷對照組(圖5A、B，P<0.05)。而IL- 10在IL- 17被中和后也呈現表達量升高，明顯高于MCMV感染組及同型抗體阻斷對照組，差異有統計學意義(圖5A、C，P<0.05)。在巨細胞病毒感染后，而IL- 17R的表達明顯高于正常對照組(圖5A、D，P<0.05)。但是，IL- 17抗體阻斷組與MCMV感染組及同型抗體阻斷對照組之間進行比較，差異無統計學意義(圖5A、D，P>0.05)，結果表明在體內中和IL- 17的表達，對IL- 17R mRNA的表達沒有影響，而可以調節IFN- γ及IL- 10 mRNA的表達。

圖3 IL- 17抗體阻斷后各組肝組織病理性損傷評估(HAI評分)Fig.3 Blocking IL- 17 in vivo,pathological changes of liver in each group of mice(HAI scoring)Note: *.P<0.01.

圖4 各實驗組血清ALT水平測定Fig.4 Levels of ATL in serumNote: *.P<0.05.

圖5 阻斷體內IL- 17后，肝臟組織中IL- 17R、IFN- γ及IL- 10的表達情況Fig.5 Blocked IL- 17 in vivo,expression of IL- 17 and IL- 17R mRNA in liver tissuesNote: *.P<0.05.1.Control；2.MCMV infected mice；3.Anti- 17 mice；4.Isotype control.

3 討論

在人類肝臟疾病中，越來越多的證據間接顯示IL- 17參與各種肝臟疾病的致病過程，包括酒精誘導的肝損傷、非酒精性脂肪性肝炎、肝細胞癌和原發性膽汁性肝硬化及肝移植術后的移植物排斥反應和自身免疫性肝炎[13，14]，并在病毒性肝炎中發揮著關鍵作用[15]。IL- 17與受體結合后，作用于kupffer細胞、單核細胞、膽管上皮細胞及星形細胞，促進促炎因子及趨化因子分泌，誘導肝臟出現炎性細胞浸潤[16，17]。我們在實驗室前期研究中發現，在MCMV播散性感染小鼠，IL- 17表達明顯增高，且肝內IL- 17高表達與肝臟病理損傷高峰期發生在同一時相，并呈明顯相關，提示IL- 17參與MCMV感染所致肝組織免疫病理性損傷的過程。為了進一步驗證IL- 17與MCMV肝損傷之間的關系，我們采用腹腔注射IL- 17抗體中和體內IL- 17進行干預。結果發現，IL- 17抗體阻斷組肝組織內IL- 17表達明顯減少，其肝組織損傷嚴重程度亦明顯輕于MCMV感染組及同型抗體阻斷組。表明IL- 17被中和以后，緩解了MCMV感染所致肝臟組織病理性損傷。同時我們實驗顯示病毒感染后IL- 17R水平升高，但中和體內的IL- 17后，其受體表達并未受到影響。有研究發現，在HSV- 1感染的角膜中，MIP- 2和MIP- 1α 是促進中性粒細胞募集最主要的炎性蛋白分子，在IL- 17R缺陷小鼠，由于中斷了IL- 17信號通路，降低炎性蛋白分子的表達并減弱了其對中性粒細胞的募集功能[16,17]。在單純皰疹病毒性角膜炎(Herpes simplex keratitis，HSK)患者，角膜中大量表達IL- 17，而且在培養的人類角膜基質纖維細胞(Human corneal stromal fibroblasts，HCF))中檢測到IL- 17R mRNA[18]。這些實驗說明IL- 17及其受體在病毒感染中發揮著重要的作用，但本實驗結果也表明在阻斷IL- 17表達后對其受體的表達并未受影響。Yoshimura[16]研究顯示，在體內阻斷IFN- γ與IL- 4表達后，體內IL- 17表達量明顯增多，并引起實驗性自身性免疫性葡萄膜炎(Murine experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)的進一步惡化。Savarin等[19]研究發現，IFN- γ可在IL- 17介導的病毒性腦脊髓炎中發揮保護作用。我們實驗結果顯示阻斷IL- 17表達后，IFN- γ的mRNA表達明顯升高，我們推斷IFN- γ可能在巨細胞病毒肝炎中同樣發揮保護作用，Zhang等[20]研究也顯示IL- 17的高表達可降低 IFN- γ 水平，與我們實驗結果相仿，說明IL- 17與IFN- γ可以相互調節。 且多項研究顯示，Treg細胞通過增強IL- 10的表達抑制Th17細胞所誘導的免疫病理性損傷，同時也能抑制Th17細胞所介導的免疫反應[18]。我們的實驗結果顯示，中和體內IL- 17后，肝臟組織內IL- 10 的表達量明顯高于MCMV感染組及同型抗體阻斷組(P<0.05)，說明IL- 17與IL- 10之間也可以相互調節，由此通過阻斷IL- 17的表達，從而增加體內IL- 10的表達量來降低組織的病理損傷。

MCMV感染的致病機制及感染結局與T細胞分泌細胞因子的功能及調節極為相關。IL- 17作為機體重要的炎性細胞因子在巨細胞病毒肝炎中發揮重要的作用，并且可以調節IFN- γ及IL- 10的表達，其在介導肝臟病理性損傷的同時，對巨細胞病毒肝炎也起到了免疫調節的作用。

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