miRNA表達與免疫細胞因子相關性在原發性肝癌早期診斷和預后中的作用①

徐曉宏 高守寶 王 玥 胡文靜

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院,齊齊哈爾 161000)

原發性肝癌(Primary hepatocellular carcinoma ，PHC)是一種進展迅速，預后很差的惡性腫瘤，是全球第五大常見腫瘤，占世界癌癥相關死亡的第三位,每年新發病例約有70萬人，其中中國患者占50%以上[1]。由于PHC早期診斷困難，大多數患者臨床確診時已達晚期，導致其5年生存率僅為10%～15%。此外，PHC治療中的耐藥性、腫瘤的復發、發展和遷移等瓶頸都亟待新的敏感特異的早期預測和早期檢測，并制定更有效的治療策略，能夠改善肝癌的臨床結果。腫瘤發生過程中的肝硬化、硬化結節轉變為癌前病變被廣泛證實及接受,絕大多數肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。因此炎癥因素及免疫因素在肝癌發生發展中的作用應該得到重視。目前Micro RNA(miRNAs)與肝癌相關性的研究已經闡明了一些miRNAs的重要意義[2]。miRNAs是一類約含20～25個核苷酸的非編碼RNA，它可以通過與靶基因3′端非翻譯區結合從而影響基因的翻譯和穩定性。一個microRNA可調節多個至數百個靶基因，幾種microRNA也可以聯合調控單一基因的表達，microRNA和靶基因間形成了復雜的調節網絡，參與細胞生長、分化、炎癥和癌變等多種生理和病理過程。目前已有大量的證據證明miRNA在PHC的發生發展中起到了十分重要的作用，包括肝細胞生長、應激反應、代謝、病毒感染與擴增、基因表達、肝表型的維持等。研究發現多種miRNAs在人類PHC細胞中異常表達[2]。這也就提示我們 miRNAs也許能夠作為PHC診斷的一種新方法。同時有研究表明miRNA能抵抗RNA內源性酶的降解從而在血漿中穩定存在。miRNAs的異常表達是否與循環及組織免疫因子相關，循環 miRNAs是否可以作為理想的血源性新型生物標志物用于腫瘤的早期檢測[3]，可能為原發性肝癌診斷的生物標記物和預后干預的靶點提供了新的研究方向。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究經齊齊哈爾醫學院倫理委員會批準，所有入組人員均簽署知情同意書。56例原發性肝癌患者選取2015年1月～2017年1月間我院腫瘤科手術或活檢診斷病例，所有患者均經病理診斷確診。男34例，女22例。年齡36～58歲，平均(47.26±5.67)歲。臨床TNM分期：Ⅱ期8例，Ⅲa期19例，Ⅲb期21例，Ⅳ期6例，Ⅴ期2例。其中36例有乙肝病史、酒精性肝硬化及20例其他非炎性病因者。所有患者經手術或活檢診斷分別切取3塊直徑約為0.5 cm的腫瘤組織和3塊癌旁組織(距離癌灶邊緣5 cm)。組織樣本離體后，迅速置入液氮中保存備用。另收集40例肝硬化患者，其中20例為肝炎后肝硬化，其余20例為酒精性或其他慢性肝病肝硬化。收集40例肝炎患者，以及68例健康對照，所有入組患者均抽取空腹靜脈血5 ml。血液樣本收集后分離血清，血清于2 h內進行相關因子檢測，血漿立即放置于-80℃保存備用。

1.2方法

1.2.1miRNA 的提取與擴增 在生物安全柜中，首先對肝癌患者肝組織、血漿以及肝硬化組、肝炎組及健康對照組血漿提總RNA,總RNA提取采用Trizol(Thermo Fisher Scientific)法提取，組織先在液氮中研磨成粉，后加入Trizol試劑，血漿直接根據體積加入Trizol試劑。通過異丙醇沉淀濃縮RNA。根據miScript Reverse Transcription Kit說明書將RNA逆轉錄成cDNA，-80℃保存。通過miRBase數據庫查找miR- 146a、miR- 224、miR- 34c、miR- 200a、miR- 148b、miR- 375成熟序列，以GAPDH為內參基因，采用熒光定量PCR方法(Real- time PCR，RT PCR)檢測miRNA表達量的變化[3]。RTPCR引物由北京華大基因設計并合成(表1)。根據QuantiTect SYBRGreen PCR Kit說明書配置PCR反應體系，反應條件如下：95℃預變性30 s；40 個PCR 循環(95℃，30 s；60℃，20 s；72℃，20 s)；以2-ΔΔCT法對miRNA表達程度進行分析(其中ΔCT為CT靶基因與CT GAPDH的差值)，2-ΔΔCT>2為表達上調，2-ΔΔCT<0.5 為表達下調[4]。

表1實時定量PCR引物序列

Tab.1PrimersequenceofReal-timequantitativePCR

miRNAsSequencesofforwardprimers(5'-3')Sequencesofreverseprimers(5'-3')GAPDHGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATGTGCAGGGTCCGAGGTmiR-34cCGCGCTAGCTTATCAGACTGAmiR-224CAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAmiR-135ACGGGGCGATATGGATTTTTmiR-200aGAGTGCATCTTACCGGACAGTmiR-148bGGCGCAAGTTCTGTTATACACmiR-375AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT

1.2.2血清腫瘤標志物檢測 選取臨床常用測血清腫瘤標志物甲胎蛋白(α- fetoprotein，AFP)、癌胚抗原 (Carcinoembryonic antigen，CEA)、CA19- 9、CA125為檢測對象，采用ADVIA Centaur CP全自動化學發光免疫分析儀對所有分離的血清進行檢測，檢測用試劑盒及質控血清均購自羅氏診斷產品(上海)有限公司，所有操作嚴格按照說明書指示進行。正常參考值:AFP:0～8.1 μg/L, CEA 0～5.0 μg/L, CA19- 9:0～39 U/ml，CA125:0～35 U/ml[5]。

1.2.3血清炎性因子檢測 采用實時熒光定量PCR探針法對血清乙肝病毒HBV DNA進行檢測，操作嚴格按照羅氏有限公司COBASAmpli- Prep- COBAS TaqMan(CAP- CTM)檢測試劑盒進行。乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體(抗- HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝e抗體(抗- HBe)、乙肝核心抗體(抗- HBc)、血清中Th1類細胞因子(IL- 12、IFN- γ和TNF- α)水平及Th2類細胞因子(IL- 4、IL- 6和IL- 10)水平采用酶聯免疫ELISA法檢測。

2 結果

2.1miRNA在血清中及癌、癌旁組織中表達情況 分別對健康組、肝炎組、肝硬化組和PHC組血清miRNA表達的相對CT值統計分析，發現相對于健康組miR- 34c(P=0.032)、miR- 224(P=0.046)、miR- 146a(P=0.027)在PHC組表達顯著上調(見圖1A)，miR- 200a(P=0.034)、miR- 148b(P=0.022)、miR- 375(P=0.030)在PHC組表達顯著下調，差異具有統計學意義。但肝炎組和肝硬化組與健康組和PHC組相比較，差異沒有統計學意義。

miRNA在組織中表達如圖1B所示，相對于癌旁組織，miR- 34c(P=0.022)、miR- 224(P=0.018)、miR- 146a(P=0.016)在PHC組表達顯著上調，miR- 200a(P=0.015)、miR- 148b(P=0.024)、miR- 375(P=0.029)在PHC組表達顯著下調，差異具有統計學意義。

2.2血清miRNAs與細胞因子表達相關性 在眾多miRNA分子中，發現miR- 375與miR- 146a表達水平與細胞因子相關，將HBsAg 、抗- HBs、抗- HBe、抗- HBc、IL- 12、IFN- γ、TNF- α、IL- 4、IL- 6和IL- 10作為自變量，血清 miR- 375 和miR- 146a的表達水平作為因變量，納入線性回歸模型進行多因素分析，結果顯示 ,HBsAg與血清miR- 375 和miR- 146a存在回歸關系，miR- 375隨HBsAg表達水平升高而降低，而miR- 146a隨HBsAg達升高而升高。 IFN- γ與miR- 146a存在回歸關系， miR- 146a隨IFN- γ表達水平降低而升高(表2、3)。

2.3血清 miR- 375 和miR- 146a的表達水平對原發性肝癌的診斷意義 利用ROC曲線，評價血清miR- 375和miR- 146a在204例研究對象中檢測出56例原發性肝癌的能力，結果顯示，miR- 375在204例研究對象中檢測出56例原發性肝癌患者的靈敏度為73.9%，特異度為93.0%，AUC為 0.838(95%CI：0.780～0.897)，miR- 146a在204例研究對象中檢測出56例原發性肝癌患者的靈敏度為74.2%，特異度為92.6%，AUC為 0.838(95%CI：0.780～0.897)，而CA19- 9和AFP 在同樣的人群中診斷出原發性肝癌患者靈敏度分別為63.0%和59.6%，特異性分別為84.2%和81.8%，AUC 分別為0.722(95%CI：0.584～0.802)和0.694(95%CI：0.602～0.784)，miR- 375 和miR- 146a診斷能力大于CA19- 9和AFP(圖2)。

2.4miRNA與細胞因子表達相關性與原發性肝癌預后相關性 未發現6例癌癥患者各miRNA分子與細胞因子表達水平與腫瘤大小、臨床分期及轉移、復發情況具有明顯相關性，提示不能明確miRNA與細胞因子表達與預后的相關性。

圖1 各mi- RNA在血清中及癌、癌旁組織中表達情況Fig.1 Relative expression levels of miRNAs in serum and tissuesNote: A.Relative expression levels of miRNAs in different groups;B.Relative expression levels of miRNAs in tumor tissues and paracancerous tissues，*.P<0.05.

表2血清miR-375與各細胞因子表達水平線性回歸分析

Tab.2LinearregressionanalysisofserummiR-375andcytokinelevels

FactorsB95%CItPHBsAg0.228(-0.416,-0.144)-2.4320.021anti-HBs0.184(-0.378,0.226)-1.4420.201anti-HBe-0.189(-0.342,0.160)-1.6410.238anti-HBc0.114(-0.082,2.385)1.3220.199IL-120.098(-0.262,0.431)1.4250.186IFN-γ0.106(-0.090,0.624)0.9860.372TNF-α0.022(-0.204,0.458)1.2120.225IL-40.078(-0.196,0.384)1.4550.169IL-60.021(-0.148,0.186)0.3680.824IL-100.057(-0.120,0.428)0.9020.522

表3血清miR-146a與各細胞因子表達水平線性回歸分析

Tab.3LinearregressionanalysisofserummiR-146aandcytokinelevels

FactorsB95%CItPHBsAg0.468(0.244,0.820)3.0260.015anti-HBs0.204(-0.087,0.456)1.4020.198anti-HBe0.154(-0.168,0.322)1.6620.204anti-HBc0.196(-0.204,0.455)1.4180.193IL-120.069(-0.182,0.316)1.0600.482IFN-γ-0.314(-0.727,-0.105)-2.2860.028TNF-α0.041(-0.196,0.262)1.1220.156IL-40.084(-0.102,0226)1.5450.149IL-60.049(-0.205,0.286)0.8740.628IL-100.132(-0.208,0.397)1.2160.178

圖2 血清 miR- 375、miR- 146a、AFP和CA19- 9在全部研究對象中診斷PHC的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum miR- 375,miR- 146a,AFP and CA19- 9 to diagnose PHC in all subjects

3 討論

原發性肝癌起病隱匿，預后不良，其發生發展過程與多種因素相關，而目前臨床主要依靠血清腫瘤標志物、活檢及影像學來診斷PHC，但這些診斷手段靈敏度及特異性都有其局限性，導致診斷價值欠佳。近年來，隨著分子生物學診斷技術不斷發展，miRNA表達異常與腫瘤相關性越來越受到關注。因此，尋找新的更加敏感和特異的PHC診斷生物標記物成為目前研究的熱點及難點。研究發現，腫瘤患者不僅腫瘤組織中miRNA表達有明顯變化，而且在其血清中miRNA的表達也呈現明顯異常。說明血清miRNA以其方便及非侵入性的優勢可用于腫瘤的早期檢測，可作為理想的診斷標志物。

本研究通過循證醫學手段，根據國內外文獻報道，篩選到miR- 146a、miR- 224、miR- 34c、miR- 200a、miR- 148b、miR- 375六個miRNA在PHC中表達異常。通過對健康組、肝炎組、肝硬化組及PHC不同疾病發展組別的血清中和組織中的miRNA表達水平的檢測，發現miR- 34c、miR- 224、miR- 146a在PHC組表達顯著上調，miR- 200a、miR- 148b、miR- 375在PHC組表達顯著下調。該結果與其他關于腫瘤組織中miRNA表達異常結果是相符的，如Chamani等[6]發現miR- 34家族表達沉默可使多種癌基因DNA甲基化，miR- 34c的異常升高上調多種癌基因表達。Shen等[7]研究發現，miR- 224在宮頸癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌和肝癌等惡性腫瘤的細胞組織中明顯表達上調，且高表達的miR- 224與腫瘤的發展及預后相關。Lin等[8]發現miR- 146a在非小細胞癌、乳腺癌、肝癌中表達異常升高，它可通過異常升高表達抑制抑癌基因FOXO1 在肝癌中的表達從而促進腫瘤細胞的增殖和細胞周期進展。Dhayat等[9]發現miR- 200a在原發性肝癌中明顯表達下調，在動物試驗中通過沉默miR- 200a可促進肝癌的發生。它可調節鈣黏蛋白和腫瘤β- 鏈蛋白(β- catenin)和腫瘤生長因子(TGF- β)等多個靶基因。Ziari等[10]比較了101例肝癌患者及40例正常對照組的miR- 148b表達水平，發現miR- 148b表達在腫瘤組織中明顯下調，且與預后相關；Mirzaei等[11]發現miR- 375、miR- 206、miR- 223在肝癌患者癌組織和循環中都檢測到異常表達， miR- 375可能影響p53、p21、PTEN、PI3K- AKT、c- myc和STAT3等重要的生物學途徑。該六種microRNAs在PHC肝癌組織和癌旁組織中的表達差異，補充了原發性肝癌miRNA的差異表達譜，為原發性肝癌提供了診斷靶分子。但由于microRNAs參與了多種靶基因和生物學途徑的調控，欲研究某一miRNAs具體功能，需通過過表達或RNA抑制等多種手段驗證其可能影響的靶基因，這將有待于進一步研究。

腫瘤發生過程中肝硬化、硬化結節轉變為癌前病變被廣泛證實及接受,絕大多數肝癌患者有肝炎及肝硬化背景。因此炎癥因素及免疫因素在肝癌發生進展中的作用應該得到重視。本研究發現，HBsAg與血清miR- 375 和miR- 146a存在回歸關系，miR- 375隨HBsAg表達水平升高而降低，而miR- 146a隨HBsAg達升高而升高。 IFN- γ與miR- 146a存在回歸關系，推測乙肝病毒感染后會引起miR- 375表達的下降 和miR- 146a表達的升高。說明病毒利用宿主自身miRNA間接調控一些蛋白和免疫因子的表達，影響機體的免疫能力，達到免疫逃逸的目的，從而為自身病毒復制與生存創造良好的條件。

眾所周知，肝癌的良好預后取決于早期診斷和治療，盡管目前臨床中活檢病理檢測是確定原發性肝癌診斷的金標準，但由于PHC發病隱匿，多數患者在確診PHC時疾病早已遷延。通過影像學和血清腫瘤標志物等無創診斷仍是肝癌普查應用較多的手段，但是難免還是有較高的漏診率和誤診率。本研究中，還發現血清 miR- 375 和miR- 146a診斷敏感性和特異性均優于CA19- 9和AFP，提示miR- 375 和miR- 146a可作為原發性肝癌，尤其是有乙肝病毒感染史患者原發性肝癌的診斷標志物。

總之，隨著對循環miRNAs的生成機制和生物學功能與原發性肝癌的關系不斷深入，通過進一步的基礎實驗和臨床研究相結合，我們可以相信，通過循環miRNAs表達異常來診斷和治療PHC將會有廣闊的臨床應用前景。

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