白介素17受體mRNA在恒河猴中的分布①

王鳳杰 李 冬 余 磊 崔艷芳 葉華虎 法云智③ 楊貴波

(中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心，北京 102206)

白介素17受體(Interleukin 17 receptor，IL- 17R)是表達在IL- 17家族細胞因子靶細胞表面的跨膜分子。IL- 17受體家族包括IL- 17RA、B、C、D、E五個成員，其中IL- 17RA是首個被發現的哺乳動物IL- 17受體，與IL- 17RC形成復合體，是IL- 17A、IL- 17A- IL- 17F、IL- 17F信號通路中必不可少的成分[1,2]。IL- 17R家族成員包含一個保守的SEFIR結構域，在與IL- 17A結合后， IL- 17RA/IL- 17RC的SEFIR與下游的ACT1相互作用激活下游信號，最終激活NF- κB信號通路[3- 5]。目前已經發現的能夠被IL- 17A激活的轉錄因子還有AP- 1、C/EBP- δ和C/EBP- β等[6]。此外，IL- 17A還參與MAPK、JNK、ERK及P38等信號通路的活化[6]，并可能參與PI3K信號的激活[3]。激活IL- 17R通路可刺激多種細胞因子 (IL- 6、G- CSF、GM- CSF)、趨化因子(CCL2、CCL7、CCL20、CXCL1、CXCL5)、抗菌肽(β- defensin- 2、S100A7、S100A8、S100A9)、黏蛋白(MUC5B、MUC5AC)和基質金屬蛋白酶(MMP1、MMP3、MMP9、MMP12、MMP13)的形成[7],一方面抑制上皮細胞周圍細菌的繁殖，維持腸道上皮屏障功能，增強腸道上皮的緊密連接結構，阻止腸內細菌或內毒素移位到其他組織器官；另一方面參與機體免疫反應的調節[8]，在自身免疫性疾病、宿主防御和腫瘤的發生發展中發揮重要作用。

已知IL- 17R在人和小鼠體內廣泛分布，造血組織中表達水平相對較高。Northern blot分析表明，小鼠的脾臟和腎臟IL- 17RA表達水平較高，其次為肺臟和肝臟，而在腦、心臟、骨骼肌和睪丸組織中的表達水平較低；IL- 17RA在鼠腸道上皮細胞、胸腺細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、肥大細胞以及淋巴瘤細胞中均有高水平的表達，而在胚胎肝臟上皮細胞和成纖維細胞中的表達水平較低[9]。利用定量PCR對小鼠組織中IL- 17R轉錄水平的分析表明，胸腺中IL- 17RA水平最高，分別為脾臟和肺中的1.5倍和4倍，在淋巴結、大腸和小腸中IL- 17RA低水平表達；而IL- 17RC在大腸和小腸中表達水平最高，為肺中的1.5倍，胸腺和脾臟中IL- 17RC水平也顯著低于腸道，淋巴結中幾乎不表達IL- 17RC。在免疫細胞中IL- 17RA和IL- 17RC的水平也存在差異，IL- 17RA在巨噬細胞中水平最高，其次為T淋巴細胞，而在B淋巴細胞和樹突狀細胞中水平相對較低；IL- 17RC在巨噬細胞和T淋巴細胞中低水平表達，B淋巴細胞、樹突狀細胞幾乎不表達[10]。

恒河猴與人類親緣關系較近，被廣泛用于建立人類疾病研究的動物模型，在艾滋病、腸道炎癥性疾病、肝炎等多種疾病的研究中具有不可替代的作用。目前已知IL- 17/IL- 17R通路與免疫系統、消化系統和呼吸系統相關疾病密切相關[11- 13]，而恒河猴可在這些疾病的研究中發揮重要作用，但對恒河猴IL- 17/IL- 17R通路的研究甚少。本研究組曾對恒河猴Th17細胞、IL- 17A及其在猴艾滋病中的作用進行過研究[14,15]，但IL- 17R在恒河猴體內的表達及分布情況至今尚無報道。本文建立定量PCR方法觀察了恒河猴中IL- 17RA mRNA的分布,并比較了恒河猴、食蟹猴和非洲綠猴PBMC中IL- 17RA和IL- 17RC mRNA的表達水平。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 反轉錄試劑盒(Promega)，凝膠回收試劑盒(Qiagen)，質粒小量提取試劑盒(Omega)，RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System- SP6 and T7(Promega)，One Step PrimeScriptTMRT- PCR Kit(TaKaRa)，淋巴細胞分層液(GE),組織RNA提取試劑盒(天根生物科技)。

1.1.2組織和細胞 本研究使用了-80℃保存的脾臟、胰臟等36種組織(詳見結果)，來自5只正常中國恒河猴(3只為雌性，2只為雄性，年齡1～2周歲)。PBMC分別來自恒河猴、非洲綠猴、食蟹猴(各10只)，通過外周血淋巴細胞分層液梯度離心法獲取。

1.2實驗方法

1.2.1RNA提取 根據組織RNA提取試劑盒說明書提取組織及PBMC中的RNA,加100 μl RNase Free H2O洗脫RNA產物，分裝后于-80℃儲存備用。

1.2.2IL- 17R標準品的構建

1.2.2.1目的片段擴增 使用恒河猴正常組織中提取的RNA進行RT- PCR 擴增,IL- 17RA基因擴增片段長414 bp，上下游引物序列分別為5′- CTC CCA GCC GGG GCT AAA CTG- 3′,5′- AGG AAA TTC TTG GAC TGG TGG- 3′；IL- 17RC基因擴增片段長582 bp，上下游引物序列分別為5′- TAG AAG ATG CCT GTG CCC TGG TT- 3′， 5′- AGG CAG CTG CTG TGT GAG GTT GA- 3′。

1.2.2.2RT- PCR產物回收和克隆 對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，按照凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段并鑒定濃度及純度。將回收產物與pGEM- T Easy Vector連接。

1.2.2.3質粒重組轉化及陽性克隆的篩選 連接產物轉化入DH5α感受態細胞，并于Amp抗性的LB瓊脂平板上37℃過夜培養，挑取單一菌落擴大培養并提取質粒,對質粒進行測序及序列分析，保存測序正確的質粒。

1.2.2.4質粒線性化和體外轉錄 用限制性核酸內切酶NcoⅠ對質粒進行酶切，回收線性化質粒。按照RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System- SP6試劑盒說明書對線性化的質粒進行體外轉錄。

1.2.2.5RNA標準品的定量和稀釋 測定體外轉錄并純化后的RNA樣品濃度及純度，用RNase Free H2O對RNA 進行10倍連續稀釋，分裝后存于-80℃備用。

1.2.3熒光定量PCR檢測 用One Step Prime ScriptTMRT- PCR Kit對樣品進行熒光定量分析，選用GAPDH作為內參基因，反應程序如下：第一步反應為42℃ 5 min，95℃ 10 s；第二步反應為95℃ 5 s，60℃ 34 s，循環數為40。熒光定量PCR數據分析軟件為ABI7500,檢測基因及內參基因的引物和探針序列見表1。

1.3統計學處理 用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據處理和分析，兩組數據間用t檢驗法進行差異分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1恒河猴各組織中IL- 17RA基因的表達水平 為了解免疫系統中IL- 17R的分布，本研究檢測了中樞淋巴組織(骨髓、胸腺)和外周淋巴組織(淋巴結、脾臟、扁桃體等)中IL- 17RA的表達水平。總體而言，IL- 17RA在免疫相關組織中表達量相對較高，其中僅髂淋巴結、骶淋巴結、胸腺和扁桃體中表達量略低于50 000 copies/106GAPDH，其余組織均高于50 000 copies/106GAPDH，腹股溝淋巴結的表達量最高，其次為腋窩淋巴結，扁桃體中表達量最低，IL- 17RA基因的表達量僅在腹股溝淋巴結和扁桃體中存在明顯的統計學差異(P=0.044 2)，見圖1A。

與免疫系統相比，消化道中IL- 17RA的表達水平普遍偏低，口腔黏膜IL- 17RA表達量最低，僅為2 810 copies/106GAPDH。大腸的表達水平高于小腸，大腸中盲腸IL- 17RA表達水平最高，結腸近端表達水平最低，小腸中十二指腸近端水平最高，空腸中部表達水平最低。 IL- 17RA在十二指腸近端、空腸近端、空回腸中部和回腸末端這四個部位的表達水平均與盲腸存在明顯的差異，具有統計學意義(P=0.025 7，P=0.018 9，P=0.013 3，P=0.020 6)，見圖1B。

本試驗所選取的5只恒河猴中有三只為雌性，兩只為雄性。本研究檢測了雌性動物的子宮頸、子宮體、卵巢、陰道以及雄性動物的睪丸和包皮中IL- 17RA的表達情況，在雌性恒河猴的子宮頸和雄性恒河猴的睪丸中IL- 17RA表達水平較高。但生殖器官中IL- 17RA水平均不存在統計學差異，且不存在明顯的性別差異，見圖1C。

除上述組織外，本研究還對胰臟、肺臟、肝臟、腎臟、心臟等內臟器官及大腦、主動脈、氣管、皮膚、肌肉等組織進行了檢測，其中胰臟IL- 17RA的水平最高，其次依次為肺臟、肝臟、腎臟、皮膚、主動脈和氣管，大腦、心臟和肌肉中表達量均低于10 000 copies/106GAPDH，在所有檢測的組織中，肌肉IL- 17RA表達水平最低，僅為370 copies/106GAPDH，見圖1D。

對免疫系統、消化系統及生殖系統相關組織中IL- 17RA的表達水平進行對比發現， IL- 17RA在各系統中的表達水平不一致，在免疫系統、消化系統及生殖系統中的表達兩兩之間差異存在顯著統計學意義(P<0.05)，見圖1E。

2.2恒河猴腸道組織中IL- 17RC基因的表達水平 IL- 17RC在消化道組織中廣泛表達，大腸中IL- 17RC的表達水平略高于小腸，大腸中直腸含量最高，其次是結腸和盲腸。但與IL- 17RA相比，IL- 17RC在大腸中的含量偏低。小腸中空腸近端表達水平最高，十二指腸近端和回腸末端含量相當，IL- 17RC在十二指腸近端和回腸末端的表達水平均與直腸存在明顯的統計學差異(P=0.023 1，P=0.011 5)，見圖2。

表1基因引物和探針序列

Tab.1Primerandprobesequenceofgenes

GenenameLengthPrimersequence(5'-3')Probesequence(5'-3')IL-17RA162bpTGGATTCACCCTCGAAACCTFAM-CACTGCAGACAGACGCCAGCATCC-TAMRAAGATAACTCTGCACCCTCGAGGTAIL-17RC311bpTAGAAGATGCCTGTGCCCTGGTTFAM-CTGGTGCTGAGGTGCCGCAAGGAGA-TAMRATCATCTTCAGGTTCTTCCCAGTGGAPDH71bpGACCACAGTCCATGCCATCAFAM-ACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCC-TAMRACATCACGCCACAGTTTCCC

圖1 IL- 17RA mRNA在恒河猴不同組織中的分布Fig.1 Distribution of IL- 17RA mRNA in different tissues of rhesus macaquesNote: A.Distribution of IL- 17RA in lymphoid tissues;BM.Bone marrow;Thy.Thymus；Spl.Spleen；Axi LN.Axillary lymph node;Mes LN.Mesentery lymph node;Lum LN.Lumbar lymph node；Sac LN.Sacral lymph node；Ili LN.Iliac lymph node；Ing LN.Inguinal lymph node；Ton.Tonsil;B.Distribution of IL- 17RA in digestive tract;Ora.Oral cavity；Sto.Stomach fundic；Duo- p.Duodenum proximal；Jei- p.Jejunum proximal；Ji- m.Jejunoileum middle；Ile- d.Ileum distal；Cae.Caecum；Col- p.Colon proximal；Col- m.Colon middle；Rec.Rectum;* showed statistically significance between Cae and Duo- p,Cae and Jej- p,Cae and Ji- m,Cae and Ile- d,Cae and Col- p,P<0.05；C.Distribution of IL- 17RA in genital tissues；D.Distribution of IL- 17RA in other tissues；E.Difference in IL- 17RA mRNA levels between the lymphoid ,digestive and genital systems;*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3恒河猴、非洲綠猴、食蟹猴PBMC中IL- 17RA和IL- 17RC mRNA水平比較 對三種猴PBMC中IL- 17RA的水平進行比較發現，恒河猴PBMC中IL- 17RA的水平最高，略高于其在小腸中的表達水平，食蟹猴PBMC中的IL- 17RA的水平約為恒河猴的1/3，而非洲綠猴PBMC中的IL- 17RA的水平最低，約為恒河猴的1/5，食蟹猴與非洲綠猴PBMC中的IL- 17RA水平沒有統計學差異，但二者與恒河猴的差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3。另外，三種猴PBMC中均未檢測到IL- 17RC的表達。

圖2 IL- 17RC mRNA在恒河猴腸道組織中的分布Fig.2 Distribution of IL- 17RC mRNA in digestive tract of rhesus macaquesNote: Duo- p.Duodenum proximal；Jei- p.Jejunum proximal；Ile- d.Ileum distal；Cae.Caecum；Col- p.Colon proximal；Rec.Rectum;*.P<0.05.

圖3 恒河猴、非洲綠猴、食蟹猴PBMC中IL- 17RA mRNA水平的比較Fig.3 Comparison of IL- 17RA mRNA levels in PBMCs of rhesus macaque,African green monkey and cynomolgus monkeyNote: RhM.Rhesus macaque；AGM.African green monkey；CyM.Cynomolgus monkey;**.P<0.01.

3 討論

為闡明IL- 17RA在恒河猴中的分布特征，本研究檢測了包括免疫系統、消化系統、生殖系統等在內的多種組織中IL- 17RA mRNA的表達情況，發現IL- 17RA mRNA在所檢測的組織中均有分布。在小鼠和人IL- 17R的研究中發現，IL- 17A可表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、嗜中性粒細胞等多種免疫細胞和上皮細胞、成纖維細胞和肝細胞等多種非造血系統細胞。由于這些細胞類型的分布大多沒有組織特異性，因此在不同組織均能檢測到IL- 17RA mRNA與預期結果相符。事實上，已有報道表明人和小鼠中IL- 17RA 的mRNA也具有廣泛的組織分布[9]。因此本研究表明恒河猴各組織中均有IL- 17A的表達，這與人和小鼠相似。

雖然在恒河猴的各器官系統中均有IL- 17RA的表達，但IL- 17RA mRNA的表達水平在各系統之間存在明顯的差異。與小鼠體內的分布相似，IL- 17RA在恒河猴體內主要分布在淋巴結、胸腺、骨髓、脾臟等造血器官，而在腸道、睪丸、心臟、肌肉等組織中水平較低。與小鼠體內分布不同，恒河猴體內IL- 17RA表達量最高的組織為淋巴結，其次為脾臟和胸腺，而小鼠體內胸腺IL- 17RA表達水平最高，其次為脾臟，且這兩個組織中IL- 17RA的水平均在淋巴結的3倍以上[10]，表明IL- 17RA的組織分布在不同種屬之間可能存在差異。目前關于IL- 17RA在人體內的分布情況研究較少， IL- 17RA能夠在原發性膠質母細胞瘤和皮膚成纖維細胞等人源細胞中表達，且在胃癌患者的癌組織中，IL- 17RA的表達水平是正常水平的4.8倍[13]，提示IL- 17RA的表達水平與機體病理生理狀態有關。

雖然各種動物之間IL- 17RA的分布存在差異，但各種動物中淋巴組織的IL- 17RA表達水平總體上都高于其他組織，這可能是因為淋巴組織是免疫細胞最集中(密度最高)的組織，而大多數類型的免疫細胞都表達IL- 17RA[9]。IL- 17/IL- 17R通路在消化道和呼吸道黏膜抗感染免疫和物理屏障維持中具有重要作用[16]。雖然恒河猴IL- 17RA mRNA在消化道中的平均水平低于淋巴組織，但由于腸道相關淋巴組織的免疫細胞超過其他所有淋巴組織的總和，因此腸道相關淋巴組織中表達的總的IL- 17RA仍然可能是最多的。

在恒河猴腸道黏膜中，大腸IL- 17RA和IL- 17RC mRNA水平均高于小腸。腸道黏膜中Th17細胞及其所分泌的IL- 17A、IL- 17F和IL- 22在抵抗病原菌侵襲中發揮了重要作用。研究表明，小鼠腸道內存在的共生菌群可將未完全分化成熟的Th17細胞吸引到回腸末端，所以正常情況下體內初始Th17細胞主要集中在大腸[17]，并在腸道微生物菌群的誘導下進一步分化，這可能與IL- 17R在大腸和小腸中分布差異有一定關系。IL- 17RA在胰臟、肺臟及肝臟等內臟器官也都有較高水平的表達，可能原因是IL- 17參與這些組織有關的疾病發展過程[18,19]。在肌肉中IL- 17R幾乎不表達，說明肌肉組織并非IL- 17發揮其生物學作用的主要場所。在生殖器官中，由于動物數量有限及個體差異，導致某些組織樣本量單一，在分析過程中可能造成誤差。

中國恒河猴和食蟹猴PBMC中IL- 17RA水平均明顯高于非洲綠猴。當非洲綠猴感染猴免疫缺陷病毒(Simian immuondeficiency virus,SIV)后，機體在免疫應答過程中產生了抗病毒核心蛋白gag蛋白的抗體，導致系統免疫活化水平較低，病毒被控制在較低水平，感染個體并沒有明顯的臨床癥狀[20]，非洲綠猴在SIV感染后系統免疫活化水平低可能與IL- 17RA在PBMC中的低水平分布有關。三種猴PBMC中均未檢測到IL- 17RC，提示在正常生理條件下， PBMC中IL- 17RC可能處在一個極低的水平，當受到IL- 6和IL- 23等炎性因子刺激后，IL- 17RC會在外周血中性粒細胞中迅速表達，與IL- 17RA共同介導炎癥反應過程[21]。

本文對恒河猴正常組織中IL- 17R的分布進行了研究，發現IL- 17RA在免疫系統中表達量最高，其次為生殖系統和消化系統；IL- 17RC在大腸中的分布高于小腸；中國恒河猴和食蟹猴PBMC中IL- 17RA水平均明顯高于非洲綠猴。本研究為IL- 17相關人類疾病研究中動物模型的選擇提供了依據，為疾病過程中IL- 17R在組織中分布的變化及IL- 17相關生物學功能研究提供了基礎。

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