BANCR對肝癌細胞HepG2增殖、侵襲和血管新生的促進作用①

張婧婧 王向鵬 楊曉煜 姬穎華 狄文玉 張清琴 申 威 于海川 路 平

(新鄉醫學院醫學檢驗學院和河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心，新鄉 453003)

肝癌嚴重威脅著人類的健康，2012年全球范圍內就有74.5萬人死于肝癌，就發病率而言在惡性腫瘤中排名第六，且呈現上升趨勢[1,2]。長鏈非編碼RNA(long non- coding RNA，lncRNA)是一類不具蛋白質編碼功能的RNA，長度大于200 nt。越來越多的報道顯示大量異常表達的lncRNAs在癌癥中起著重要作用。Li等[3]發現胃癌腫瘤組織中存在多種異常表達的lncRNAs，其中有135種lncRNAs的表達量是正常組織的2倍以上。在肝癌中，微陣列分析也發現了許多異常表達的lncRNAs[4]。且這些lncRNAs與腫瘤發生、遷移、預后及診斷等存在著密切聯系[5,6]。BRAF 基因激活的非編碼 RNA(BRAF- activated non- coding RNA，BANCR)作為lncRNAs的一種，在惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌等多種癌癥中都是異常表達，且與這些癌癥的細胞增殖、遷移和侵襲相關[7]。有研究表明在109例肝細胞癌組織中，BANCR表達上調[8]。但運用siRNA干擾BANCR對人肝癌細胞HepG2生物學功能的影響還鮮有報道。本文將對人肝癌細胞HepG2中siRNA干擾BANCR后在細胞增殖、遷移和血管新生方面的影響進行探討，為尋找新的肝癌治療方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑 人肝癌細胞HepG2購自四川大學華西醫院再生醫學研究中心衛生部移植工程和移植免疫重點實驗室，由實驗室保種。人臍靜脈內皮細胞HUVEC購自美國典型培養物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。培養基DMEM和胎牛血清購于美國Invitrogen英駿公司。Cell Counting Kit- 8 (CCK- 8)購自日本同仁化學公司。細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit和Transwell小室及人工基底膜均購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞培養基為添加了10%胎牛血清和1%青- 鏈霉素的DMEM培養基，并置于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞增殖到約80%時，PBS洗一次，胰酶消化2 min，加入細胞培養液終止消化，23℃ 1 500 r/min離心5 min，收集細胞，立即重懸細胞，1∶5 傳代繼續培養。

1.2.2CCK- 8檢測細胞增殖 BANCR siRNA和Scramble分別轉染HepG2細胞，轉染0、1、2、3、4 d后，用CCK- 8試劑盒對轉染BANCR siRNA、Scramble和未轉染的三組細胞的增殖進行檢測。CCK- 8溶液預先用正常的培養基稀釋到10%，細胞重懸于上述稀釋液中，于37℃培養1～4 h，450 nm處檢測吸光值，計算細胞增殖倍數。

1.2.3流式細胞術分析細胞凋亡 轉染48～72 h后，收集三組細胞，并重懸于1×Binding buffer中，使細胞量達到1×106ml-1。然后利用Annexin V- fluorescein isothiocyanate (FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min，利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測，統計細胞凋亡率。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲能力 首先細胞懸浮于含1%胎牛血清的DMEM培養基中至細胞密度為1 × 106ml-1，然后將細胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養基。37℃培養24 h后，用0.5%的結晶紫對上室底部細胞進行染色，并用棉簽將上室內側的細胞除去。顯微鏡下觀察細胞形態并統計細胞數量。

1.2.5管腔形成實驗 收集各組細胞不換液培養的連續培養3 d的培養基，離心取上清。將上清與培養基等比例混合加入到鋪有Matrigel基質膠的孔板中。然后取5 × 105ml-1的HUVEC細胞加入上述孔板中，共培養72 h后倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6免疫印跡分析蛋白質的表達 收集細胞，PBS洗3次，然后加入已添加PMSF、DTT和蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解，后提取總蛋白。等量的蛋白進行SDS- PAGE凝膠電泳分離，然后轉至PVDF膜。用5%的BSA進行封閉后，依次孵育一抗和二抗，最后進行顯色。

1.3統計學分析 利用SPSS16.0對實驗數據進行統計學分析。兩兩比較采用獨立的t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1CCK- 8檢測HepG2的細胞增殖 利用qRT- PCR檢測人肝癌細胞HepG2和正常肝細胞L02中BANCR的表達，如圖1A所示，BANCR在HepG2中的表達明顯高于L02(P<0.05)。運用BANCR siRNA對人肝癌細胞HepG2的BANCR進行干擾，轉染Scramble作為干擾對照組，未轉染細胞HepG2作為陰性對照組，檢測了HepG2中BANCR的表達情況。圖1B結果顯示轉入BANCR siRNA后BANCR的相對表達量明顯低于對照組(P<0.05)?？梢?，BANCR確實被沉默了。另外檢測BANCR siRNA轉染不同天數下，細胞的增殖倍數。圖1C的結果表明，轉染BANCR siRNA 3 d以后，HepG2的細胞增殖倍數明顯低于對照組(P<0.05)。由此可見，BANCR在HepG2中高表達，用BANCR siRNA干擾BANCR后，HepG2的細胞增殖能力明顯受到抑制。

2.2流式細胞術分析HepG2的細胞凋亡 用Annexin V- FITC和PI對3組細胞進行雙染后，從圖2A的散點圖可以看出，與對照組相比，BANCR siRNA干擾BANCR后，HepG2的細胞凋亡顯著升高了。進一步對細胞凋亡率進行統計分析，圖2B結果顯示，BANCR siRNA組的細胞凋亡率明顯增加了，約大于對照組的2倍(P<0.05)。從這些結果可以看出，BANCR siRNA干擾HepG2的BANCR后促進了細胞凋亡。

2.3HepG2細胞侵襲能力檢測 運用鋪有人工基底膜Matrigel的Transwell小室對3組細胞的侵襲能力進行分析。結晶紫染色后顯微鏡觀察，與對照組相比，BANCR siRNA組穿過Transwell上室的細胞明顯少于對照組(圖3A)。為了進行定量分析，隨機選取5個視野，統計每個視野下的細胞數量。從圖3B的統計結果不難看出，BANCR siRNA組平均每個視野的細胞數量明顯低于對照組，約為對照組的三分之一(P<0.05)?？梢?，利用siRNA對HepG2細胞的BANCR進行干擾后，HepG2細胞的侵襲能力受到了嚴重影響。

2.4免疫印跡檢測細胞增殖、凋亡和侵襲標記蛋白的表達 為了進一步驗證BANCR siRNA對肝癌細胞HepG2細胞增殖、凋亡和侵襲方面的影響，利用免疫印跡技術對細胞增殖標記蛋白PCNA、凋亡標記蛋白Caspase- 3和侵襲標記蛋白MMP- 9、Fn、Vimentin進行了表達分析，GAPDH作為內參。由圖4A的免疫印跡結果圖可以看出，BANCR siRNA組細胞增殖標記蛋白PCNA和侵襲標記蛋白MMP- 9的表達都明顯低于對照組；而BANCR siRNA組細胞凋亡標記蛋白Caspase- 3的表達明顯高于對照組。進一步對免疫印跡的結果進行統計分析，結果顯示，與對照組相比，細胞增殖標記蛋白PCNA在BANCR siRNA組的相對表達量顯著降低，約為對照組的六分之一；細胞凋亡標記蛋白Caspase- 3在BANCR siRNA組的相對表達量明顯高于對照組，約為對照組的六倍；侵襲標記蛋白MMP- 9、Fn和Vimentin在BANCR siRNA組的相對表達量則低于對照組(P<0.05，圖4B～F)。綜上所述，BANCR siRNA對人肝癌細胞HepG2的增殖和侵襲具有抑制作用，并促進細胞凋亡。

圖1 qRT- PCR檢測BANCR表達(A、B)和CCK- 8檢測HepG2細胞增殖(C)Fig.1 Expression of BANCR was detected by qRT- PCR (A,B) and cell proliferation of HepG2 was tested by CCK- 8 (C)Note: A.The expression of BANCR in hepatocarcinoma cell line HepG2,*.P<0.05 versus normal hepatocyte L02；B.The expression of BANCR in hepatocarcinoma cell line HepG2 transfected with BANCR siRNA；C.Cell proliferation of HepG2 transfected with BANCR siRNA,*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖2 流式細胞分析HepG2細胞凋亡Fig.2 Cell apoptosis of HepG2 was measured by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram represents the statistical analysis of flow cytometry.*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖3 Transwell分析HepG2細胞侵襲(結晶紫染色，×100)Fig.3 Invasion of HepG2 was detected by transwell(invasion crystal violet staining，×100)Note: A.Invasion of HepG2 was detected by transwell invasion；B.Histogram represents the statistical analysis of transwell invasion.*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖4 免疫印跡檢測細胞增殖、凋亡和侵襲標記蛋白的表達Fig.4 Expression of cell proliferation,apoptosis and invasion marker proteins was tested by Western blot Note: A.Expression of PCNA,Caspase- 3,MMP- 9,Fn,Vimentin was measured by Western blot；B-F.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.*.P<0.05 versus HepG2 group.

圖5 管腔形成實驗及免疫印跡檢測血管新生因子的蛋白表達Fig.5 Tube formation assay and expression of angiogenic factors was measured by Western blotNote: A.Tube formation assay.B.Expression of VEGF，bFGF and IFN- γ was detected by by Western blot；C-E.Histogram represents the statistical analysis of Western blot.*.P<0.05 versus HepG2 group.

2.5管腔形成分析及促血管新生因子血管內皮細胞生長因子(VEGF)、酸性成纖維細胞生長因子(bFGF)以及血管新生抑制因子γ干擾素(IFN- γ)的蛋白表達分析 利用管腔形成實驗分析BANCR對血管新生的影響。圖5A顯示，轉染BANCR siRNA后，血管新生能力明顯減弱。免疫印跡對促血管新生相關因子VEGF、bFGF和IFN- γ的蛋白表達進行分析，GAPDH作為內參。免疫印跡結果圖顯示，促血管新生因子VEGF和 bFGF在BANCR siRNA組中 的蛋白表達都明顯低于對照組，血管新生抑制因子IFN- γ在BANCR siRNA組中 的蛋白表達明顯高于對照組(圖5B)。從圖5C～E的統計結果不難看出，BANCR siRNA組VEGF的相對表達量約為對照組的三分之一；bFGF的相對表達量約為對照組的一半；IFN- γ的相對表達量約為對照組的兩倍(P<0.05)。由此可見，siRNA干擾BANCR后會抑制人肝癌細胞HepG2的促血管新生因子VEGF、bFGF表達，促進血管新生抑制因子IFN- γ的蛋白表達而影響血管新生。

3 討論

中國的肝癌病例約占全世界的50%，目前較為普遍的治療方法包括外科切除、肝臟移植、射頻消融治療等[1,2]。但是當肝癌發展到晚期后僅有15%的癌癥患者適合外科手術，且只有33%～50%的患者可以存活5年[9]。因此，尋找有效的肝癌治療手段就顯得十分緊迫。

LncRNAs具有多種生物學功能，在信使RNA前體剪切、基因表達調控以及染色質修飾等方面都起著重要的作用[10- 12]。越來越多的研究表明，LncRNAs與癌癥存在緊密聯系，多種癌癥中都出現了大量的LncRNAs異常表達情況。在結腸直腸癌中，有762種LncRNAs的表達與正常組織存在顯著差異，其中390種上調表達、372種下調表達[13]。LncRNA MEG3和GHET1的沉默會影響結腸直腸癌細胞的增殖[14,15]。全基因組分析發現肝癌中存在2 736種表達異常的LncRNAs，其中1 757種Lnc RNAs的表達高于正常組織的2倍以上，979種Lnc RNAs表達下調，這揭示了lncRNAs在肝癌中起著重要作用[16]。有研究表明LncRNA TUG1在肝細胞癌組織中高表達，沉默TUG1會抑制細胞增殖和促進細胞凋亡[17]。Xu等[18]發現LncRNA URCH在肝細胞癌組織和肝細胞癌細胞系中都是高表達的，體外實驗證實了抑制URCH的表達會降低細胞增殖能力并促進細胞凋亡。

BANCR作為一種長鏈非編碼RNA，其在各種癌癥中的功能也受到了廣泛關注。BANCR在結腸直腸癌中的表達明顯低于正常組織，且過表達BANCR會抑制細胞增殖[19]。有研究還顯示，BANCR在膀胱癌和肺癌中均低表達，過表達BANCR會抑制膀胱癌細胞增殖促進細胞凋亡；沉默BANCR會促進肺癌細胞增殖[20,21]。此外，已報道BANCR在肝癌組織和細胞系中過表達，下調BANCR的表達可抑制肝癌細胞系Hep3B細胞增殖，促進細胞凋亡[22]。從前人的研究中可以看出，BANCR在不同癌癥中的表達及功能存在一定的差異。一方面這可能是由于不同癌癥的微環境造成的[22]。另一方面BANCR在各種癌癥中的不同調控機制也會造成BANCR功能的差異。在肺癌中BANCR通過P38和JNK通路實現細胞增殖調控與ERK、Raf- 1無關[21]。但在黑色素瘤中則通過ERK、Raf- 1和JNK通路來實施細胞增殖調控而與P38 通路無關[22]。本研究發現在肝癌細胞HepG2中，siRNA干擾BANCR后，細胞增殖率降低，凋亡率增加，進一步研究檢測到增殖標記蛋白表達水平降低，凋亡標記蛋白表達水平升高。這些結果表明BANCR siRNA可以抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。

LncRNAs在癌癥侵襲方面也發揮著重要作用。LncRNA ANCR表達的下調會抑制結腸直腸癌細胞的侵襲[23]。有數據顯示，lncRNA CCAT1可以促進結腸癌細胞侵襲[24]。CCAT1在肝細胞癌中也起著類似的功能，沉默CCAT1后會導致肝癌細胞HepG2和MHCC- 97H侵襲能力的降低[25]。BANCR在結腸直腸癌、膀胱癌和肺癌中都是低表達的，在1型子宮內膜癌卻是高表達，而且BANCR表達的下調會導致細胞侵襲受阻[26]。與本研究結果一致，BANCR siNRA可減少肝癌細胞HepG2侵襲細胞數目，降低侵襲標記蛋白的表達水平。本研究結果表明，BANCRsiNRA可抑制肝癌細胞的運動能力。

血管新生在腫瘤的生長過程中起著十分重要的作用，越來越多的癌癥治療策略關注在血管新生相關因子方面[27- 29]。許多LncRNAs都可以調節癌癥的血管新生。Huang等[30]發現lncRNA MALAT1可以促進甲狀腺癌的血管新生。有研究表明，LncRNA CRNDE的沉默會抑制肝母細胞瘤的血管新生[31]。有數據顯示，沉默惡性膠質瘤細胞U87MG和U251MG中lncRNA TUG1的表達，會大大降低促血管新生因子VEGFA的表達[32]。許多文獻報道了IFN- γ具有抗腫瘤的作用。有數據顯示IFN- γ可以抑制胃癌細胞增殖來起到抗腫瘤的作用[33]。在膽囊癌中，IFN- γ具有抑制血管新生的功能[34]。本研究發現BANCR siNRA干擾HepG2后，會抑制血管新生能力，抑制促血管新生因子VEGF、bFGF表達，促進IFN- γ的表達，提示BANCRsiNRA可抑制肝癌細胞的血管新生。

綜上所述，本研究發現BANCR在肝癌細胞HepG2中高表達，BANCR siRNA轉染肝癌細胞HepG2后，細胞增殖倍數降低，細胞凋亡率增加，細胞侵襲能力和血管新生能力降低。BANCR siRNA顯著抑制肝癌HepG2細胞增殖標記蛋白PCNA、侵襲標記蛋白MMP- 9、Fn和Vimentin和促血管新生因子VEFG、bFGF表達，促進血管抑制因子INF- γ的表達并促進了細胞凋亡標記蛋白Caspase- 3的表達。本文通過siRNA干擾肝癌細胞系HepG2中BANCR的表達促進細胞凋亡，抑制細胞生存能力和運動能力及血管新生，下一步研究計劃將建立HepG2腫瘤小鼠模型，在體內研究BANCR對肝癌增殖、遷移和血管新生的影響，并尋找BANCR的作用靶點建立相應的信號通路為尋找有效的生物靶向藥物提供新的方向。

[1] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，etal.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359- 86.

[2] Zhu ZX，Huang JW，Liao MH，etal.Treatment strategy for hepatocellular carcinoma in China:radiofrequency ablation versus liver resection[J].Jpn J Clin Oncol,2016,46(12):1075- 1080.

[3] Li PF，Chen SC，Xia T，etal.Non- coding RNAs and gastric cancer[J].World J Gastroenterol,2014,20(18):5411- 5419.

[4] Zhu J，Liu S，Ye F，etal.The long noncoding RNA expression profile of hepatocellular carcinoma identified by microarray analysis[J].PLoS One,2014,9(7):e101707.

[5] He Y，Meng XM，Huang C，etal.Long noncoding RNAs:Novel insights into hepatocelluarcarcinoma[J].Cancer Lett,2014,344(1):20- 27.

[6] Li G，Zhang H，Wan X，etal.Long noncoding RNA plays a key role in metastasis and prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Biomed Res Int,2014,2014:780521.

[7] 湯 菁，王朝霞.長非編碼RNA BANCR在腫瘤研究中的進展[J].現代腫瘤醫學，2017,25(3):478- 482.

Tang Q,Wang ZX.Reasearch progress of long non- coding RNA BANCR in tumor[J].J Modern Oncol,2017,25(3):478- 482.

[8] 趙 冀，周 超，李宏敏，等.長鏈非編碼RNA BANCR在肝細胞癌組織中表達上調及其對患者疾病預后價值探討 [J].重慶醫學，2017,46(2):148- 151.

Zhao Y,Zhou C,Li HM,etal.Expression up- regulation of lncRNA BANCR in hepatocellular carcinoma tissue and its prognostic value on patients′ disease[J].Chongqing Med,2017,46(2):148- 151.

[9] Roxburgh P，Evans TR.Systemic therapy of hepatocellular carcinoma:are we making progress?[J].Adv Ther,2008,25(11):1089- 1104.

[10] Davidovich C，Cech TR.The recruitment of chromatin modifiers by long noncoding RNAs:lessons from PRC2[J].Rna,2015,21(12):2007- 2022.

[11] Engreitz JM，Haines JE，Perez EM，etal.Local regulation of gene expression by lncRNA promoters,transcription and splicing[J].Nature,2016,539(7629):452- 455.

[12] Gonzalez I，Munita R，Agirre E，etal.A lncRNA regulates alternative splicing via establishment of a splicing- specific chromatin signature[J].Nat Struct Mol Biol,2015,22(5):370- 376.

[13] Xue Y，Ma G，Gu D，etal.Genome- wide analysis of long noncoding RNA signature in human colorectal cancer[J].Gene,2015,556(2):227- 234.

[14] Yin DD，Liu ZJ，Zhang E，etal.Decreased expression of long noncoding RNA MEG3 affects cell proliferation and predicts a poor prognosis in patients with colorectal cancer[J].Tumour Biol,2015,36(6):4851- 4859.

[15] Zhou J，Li X，Wu M，etal.Knockdown of long noncoding RNA GHET1 inhibits cell proliferation and invasion of colorectal cancer[J].Oncol Res,2016,23(6):303- 309.

[16] Dong R，Jia D，Xue P，etal.Genome- wide analysis of long noncoding RNA (lncRNA)expression in hepatoblastomatissues[J].PLoS One,2014,9(1):e85599.

[17] Huang MD，Chen WM，Qi FZ，etal.Long non- coding RNA TUG1 is up- regulated in hepatocellular carcinoma and promotes cell growth and apoptosis by epigenetically silencing of KLF2[J].Mol Cancer,2015,14:165.

[18] Xu WH，Zhang JB，Dang Z，etal.Long non- coding RNA URHC regulates cell proliferation and apoptosis via ZAK through the ERK/MAPK signaling pathway in hepatocellular carcinoma[J].Int J Biol Sci,2014,10(7):664- 676.

[19] Shi Y，Liu Y，Wang J，etal.Downregulated long noncoding RNA BANCR promotes the proliferation of colorectal cancer cells via downregualtion of p21 expression[J].PLoS One,2015,10(4):e0122679.

[20] He A，Liu Y，Chen Z，etal.Over- expression of long noncoding RNA BANCR inhibits malignant phenotypes of human bladder cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35(1):125.

[21] Jiang W，Zhang D，Xu B，etal.Long non- coding RNA BANCR promotes proliferation and migration of lung carcinoma via MAPK pathways[J].Biomed Pharmacother,2015,69:90- 95.

[22] Zhou T，Gao Y.Increased expression of LncRNA BANCR and its prognostic significance in human hepatocellular carcinoma[J].World J SurgOncol,2016,14(1):8.

[23] Yang ZY，Yang F，Zhang YL，etal.LncRNA- ANCR down- regulation suppresses invasion and migration of colorectal cancer cells by regulating EZH2 expression[J].Cancer Biomark,2017,18(1):95- 104.

[24] He X，Tan X，Wang X，etal.C- Myc- activated long noncoding RNA CCAT1 promotes colon cancer cell proliferation and invasion[J].Tumour Biol,2014,35(12):12181- 12188.

[25] Zhu H，Zhou X，Chang H，etal.CCAT1 promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):5427- 5434.

[26] Wang D，Wang D，Wang N，etal.Long non- coding RNA BANCR promotes endometrial cancer cell proliferation and invasion by regulating MMP2 and MMP1 via ERK/MAPK signaling pathway[J].Cell Physiol Biochem,2016,40(3- 4):644- 656.

[27] Zhao Y，Adjei AA.Targeting angiogenesis in cancer therapy:moving beyond vascular endothelial growth factor[J].Oncologist,2015,20(6):660- 673.

[28] El- Kenawi AE，El- Remessy AB.Angiogenesis inhibitors in cancer therapy:mechanistic perspective on classification and treatment rationales[J].Br J Pharmacol,2013,170(4):712- 729.

[29] Welti J，Loges S，Dimmeler S，etal.Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer[J].J Clin Invest,2013,123(8):3190- 3200.

[30] Huang JK，Song WH，Lu BY，etal.LncRNA- MALAT1 promotes angiogenesis of thyroid cancer by modulating tumor- associated macrophage FGF2 protein secretion[J].J Cell Biochem,2017,118(12):4821- 4830.

[31] Dong R，Liu XQ，Zhang BB，etal.Long non- coding RNA- CRNDE:a novel regulator of tumor growth and angiogenesis in hepatoblastoma[J].Oncotarget,2017,8(26):42087- 42097.

[32] Cai H，Liu X，Zheng J，etal.Long non- coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor- induced angiogenesis through inhibiting microRNA- 299 in human glioblastoma[J].Oncogene,2017,36(3):318- 331.

[33] Zhao YH，Wang T，Yu GF，etal.Anti- proliferation effects of interferon- gamma on gastric cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(9):5513- 5518.

[34] Sun T，Yang Y，Luo X，etal.Inhibition of tumor angiogenesis by interferon- gamma by suppression of tumor- associated macrophage differentiation[J].Oncol Res,2014,21(5):227- 235.