TIPE2抑制AP- 1蛋白增加人非小細胞肺癌細胞系NCI- H1975化療敏感性的機制研究

王 穎 劉英宇 張文艷

(河北省唐山工人醫(yī)院呼吸內(nèi)科,唐山 063000)

TIPE2(Tumor necrosis factor- a induced protein 8- like 2，TNFAIP8L2)是2008年新發(fā)現(xiàn)的一個維持免疫系統(tǒng)自穩(wěn)平衡必需的基因之一，屬于TIPE家族成員，具有與死亡受體結(jié)構(gòu)域相似的結(jié)構(gòu)域和6個保守的α螺旋結(jié)構(gòu)，TIPE2與TNFAIP8L1(TIPE1)和TNFAIP8L3(TIPE3)同屬于TNFAIP8家族，是一種重要的腫瘤抑制分子[1]。

肺癌是世界范圍內(nèi)危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，其中80%～85%是非小細胞肺癌。根治手術(shù)是肺癌的主要治療策略，盡管手術(shù)有所進展，但肺癌患者的5年生存率仍然不夠理想，統(tǒng)計表明中國肺癌的中位生存期僅為22.7個月[2]。因此新型輔助化療(例如CDDP)仍是非小細胞肺癌治療的重要手段。盡管靶向治療效果顯著，但EGFR基因突變在吸煙的肺癌患者中發(fā)生率偏低，其突變率僅為30%，因此在吸煙患者中運用靶向治療效果欠佳。同時在臨床應用中，順鉑(CDDP)治療則有腫瘤耐藥現(xiàn)象發(fā)生，從而導致治療失敗，因此逆轉(zhuǎn)肺癌細胞腫瘤耐藥至關(guān)重要。有研究表明AP- 1蛋白在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用[3]，且TIPE2是AP- 1蛋白的直接抑制分子[4,5]。本研究旨在探討TIPE2是否在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥方面發(fā)揮重要功能。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系和載體 人非小細胞肺癌系NCI- H1975從中國科學院上海細胞生物研究所購買，并在含有10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Gibco,Australia)。TIPE2慢病毒載體由上海Genechem公司構(gòu)建。

1.1.2儀器與試劑 流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品(FACS Calibur,BD,USA)，多功能酶標儀為Thermofisher公司產(chǎn)品(VarioskanFlash,Thermo,USA)；CCK8及Annexin5- PI雙染凋亡試劑盒購自Dojindo公司(Dojindo,Shanghai,China)，CDDP為山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品(QiLu Pharmaceutical,Jinan,China)，實時熒光定量試劑盒PrimeScriptTM購自TaKaRa公司(TaKaRa,Dalian,China)，TRIzol 購自Invitrogen公司(Invitrogen,California,USA)，AP- 1抗體購自CST公司(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)，TIPE2抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品(Santa Cruz Biotechnology,USA)，MDR1抗體為Bio- Legend 公司產(chǎn)品(Bio- Legend,San Diego,CA)。

1.2方法 非小細胞肺癌系NCI- H1975轉(zhuǎn)入TIPE2慢病毒載體后，加入CDDP 10 μg/ml，培養(yǎng)24 h，使用Cell Counting Kit- 8(CCK- 8)測量IC50值。 根據(jù)文獻報道，細胞毒性指數(shù)計算為(1-藥物處理細胞OD450/未處理細胞的OD450)×100%，使用GraphPad Prism 5計算CDDP的IC50值。TIPE2轉(zhuǎn)染細胞后，用CDDP(10 μg/ml)處理24 h后，凋亡細胞用AnnexinV/FITC和PI凋亡檢測試劑盒進行檢測。使用含RIPA的蛋白裂解液提取上述經(jīng)CDDP作用的細胞總蛋白，按操作說明進行，最后將膜與TIPE2抗體、AP- 1抗體及MDR- 1抗體進行孵育，膠片曝光檢測蛋白表達量，GAPDH作為內(nèi)參。TRIzol處理細胞后，PrimeScriptTM試劑盒提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,熒光定量PCR儀檢測炎性因子表達水平，18S rRNA作為內(nèi)參。

圖1 轉(zhuǎn)染TIPE2后IC50值明顯降低Fig.1 Decreased IC50 after transfected with TIPE2

1.3統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism5.0.軟件(GraphPad Software,San Diego,CA)進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)皆采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1TIPE2降低非小細胞肺癌系NCI- H1975細胞IC50值 結(jié)果表明，用TIPE2過表達慢病毒感染的非小細胞肺癌系NCI- H1975細胞，經(jīng)CDDP作用24 h后，IC50(半數(shù)致死量)測定顯示與對照組相比TIPE2過表達顯著增加CDDP誘導的細胞毒性(圖1，P<0.001)。

2.2TIPE2增加非小細胞肺癌系NCI- H1975細胞對CDDP的凋亡率 為了進一步證實TIPE2的功能，用CDDP處理TIPE2過表達細胞及對照組。 和預期相同，過表達TIPE2組增強CDDP誘導的NCI- H1975細胞凋亡，使用Annexin V和碘化丙啶染色后流式細胞儀判斷如圖2所示(P<0.05)。

2.3TIPE2降低非小細胞肺癌系NCI- H1975細胞中AP- 1及MDR1的表達量 過表達TIPE2后，NCI- H1975細胞AP- 1及MDR1表達量下調(diào)，有研究表明TIPE2是AP- 1的直接作用抑制分子，而AP- 1可以增加腫瘤細胞耐藥性。MDR1則是介導腫瘤耐藥的主要分子之一。本實驗初步表明TIPE2增強CDDP對NCI- H1975細胞的化療敏感性可能是通過下調(diào)AP- 1分子，如圖3。

2.4TIPE2降低非小細胞肺癌系NCI- H1975細胞中炎性因子IL- 1、IL- 6及TNF- α mRNA水平 用CDDP處理TIPE2過表達細胞及對照組，過表達TIPE2組中炎性因子IL- 1、IL- 6及TNF- α mRNA水平明顯降低，已有研究證實炎性因子比如IL- 6的增多可誘導腫瘤細胞耐藥性，本結(jié)果表明TIPE2可能通過抑制AP- 1間接降低炎性因子分泌，從而降低腫瘤細胞耐藥性。如圖4所示(P<0.01)。

圖2 TIPE2增加CDDP誘導的細胞凋亡Fig.2 Increased apoptosis after transfected with TIPE2Note: *.P<0.05.

圖3 TIPE2 明顯降低AP- 1及MDR1蛋白表達水平Fig.3 Decreased expression of AP- 1 and MDR1 after transfected with TIPE2

圖4 TIPE2 明顯降低IL- 1、IL- 6及TNF- α mRNA表達水平Fig.4 Decreased mRNA expression of IL- 1，IL- 6 and TNF- α after transfected with TIPE2Note: *.P<0.01.

3 討論

對于不適合靶向治療的非小細胞肺癌患者，腫瘤耐藥仍然是治療失敗的重要原因，特別是那些IV期癌癥患者。腫瘤耐藥機制主要包括ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體超家族(例如MDR1)介導的細胞內(nèi)藥物聚積及藥物流出增加，p53、Bcl- 2或miRNAs介導的凋亡抑制機制，以及表達上調(diào)的錯配修復基因等[6]。研究數(shù)據(jù)顯示，MDR1的表達增加與腫瘤細胞耐藥密切相關(guān)，MDR1編碼的蛋白P- gp過表達對腫瘤進展有促進作用，使其有更高的復發(fā)率和轉(zhuǎn)移風險[7,8]。因此，調(diào)控MDR1被認為是克服腫瘤耐藥的主要策略之一。

已有研究證實TIPE家族另一成員TIPE(TNFAIP8)在胃癌腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用[9]。TIPE2是炎性疾病的負調(diào)節(jié)因子，一般情況下，TIPE2表達降低與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與腫瘤分期呈高度負相關(guān)性[1]。研究發(fā)現(xiàn)TIPE2通過抑制HCC中AKT和Ral的激活，可以結(jié)合并抑制Rac蛋白[10]。此外，TIPE2可抑制TNF介導的Erk1/2和NF- κB通路的活化[11]，并通過上調(diào)N- ras和p27表達阻止胃癌細胞增殖[12]。然而迄今為止，還沒有關(guān)于TIPE2在腫瘤耐藥機制中的作用研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)在過表達TIPE2的非小細胞肺癌系NCI- H1975細胞對CDDP敏感性增強，表現(xiàn)為IC50(半數(shù)致死量)明顯降低，表明轉(zhuǎn)染TIPE2后，只需要更小劑量的化療藥物就可以殺死腫瘤細胞。AnnexinⅤ和PI雙染提示轉(zhuǎn)染TIPE2后，在相同劑量的CDDP作用下，腫瘤細胞凋亡率明顯增多。TIPE2分子是AP- 1的直接抑制分子，而AP- 1可激活MDR1的轉(zhuǎn)錄表達，AP- 1和MDR1的同時下降，表明 TIPE2可能是通過抑制AP- 1從而導致MDR1表達下調(diào)。MDR1/P- gp的主要功能是導致腫瘤細胞中抗腫瘤藥物外排增加[13]，是導致多藥耐藥(MDR)的關(guān)鍵因素[14]。AP- 1家族主要由原癌基因c- Jun和c- Fos組成，它們位于Ras/Raf途徑的下游，對細胞增殖、腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥至關(guān)重要[15,16]。 據(jù)我們所知，MDR1表達需要AP- 1與其啟動子的結(jié)合，其中c- Jun和c- Fos在調(diào)節(jié)MDR1中起主要作用。蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染TIPE2后，AP- 1明顯下調(diào)，同時對腫瘤耐藥起決定性作用的MDR1蛋白亦明顯下降，該結(jié)果提示TIPE2的過表達抑制AP- 1蛋白表達，導致MDR1表達水平明顯降低，從而引起對化療藥物的敏感性更高。炎癥因子例如IL- 6及TNF- α等在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用[17]，提示TIPE2作為炎性負調(diào)控分子可能在其中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TIPE2然后用CDDP處理后炎性因子較對照組明顯降低。AP- 1在炎性因子產(chǎn)生中起決定性作用，本研究結(jié)果表明TIPE2可能通過抑制AP- 1進而抑制炎癥因子產(chǎn)生，從而間接參與腫瘤耐藥形成。

我們的實驗首次證實TIPE2蛋白可以增加腫瘤化療敏感性，為逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥及增強化療藥物生物學作用、減少化療藥物毒副作用提供了理論可能。

[1] Goldsmith JR,Chen YH.Regulation of inflammation and tumorigenesis by the TIPE family of phospholipid transfer proteins[J].Cell Mol Immunol,2017，14(6):482- 487.

[2] Fan H,Shao ZY,Xiao YY,etal.Incidence and survival of non- small cell lung cancer in Shanghai:a population- based cohort study[J].BMJ Open,2015，5(12):e009419.

[3] Hsu SI,Cohen D,Kirschner LS,etal.Structural analysis of the mouse mdr1a(P- glycoprotein)promoter reveals the basis for differential transcript heterogeneity in multidrug- resistant J774.2 cells[J].Mol Cell Biol,1990，10(7):3596- 3606.

[4] Sun H,Gong S,Carmody RJ,etal.TIPE2,a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis[J].Cell,2008，133(3):415- 426.

[5] Oho M,Nakano R,Nakayama R,etal.TIPE2(tumor necrosis factor alpha- induced protein 8- like 2)is a novel negative regulator of TAK1 signal[J].J Biol Chem,2016，291(43):22650- 22660.

[6] Li S,Sun W,Wang H,etal.Research progress on the multidrug resistance mechanisms of osteosarcoma chemotherapy and reversal[J].Tumour Biol,2015，36(3):1329- 1338.

[7] Wessler JD,Grip LT,Mendell J,etal.The P- glycoprotein transport system and cardiovascular drugs[J].J Am Coll Cardiol,2013，61(25):2495- 2502.

[8] Gillet JP,Gottesman MM.Mechanisms of multidrug resistance in cancer[J].Methods Mol Biol,2010，596:47- 76.

[9] Gus- Brautbar Y,Johnson D,Zhang L,etal.The anti- inflammatory TIPE2 is an inhibitor of the oncogenic Ras[J].Mol Cell,2012，45(5):610- 618.

[10] 李莉娜，畢志彬，王金勝.TNFAIP8與胃癌耐藥關(guān)系的初步研究 [J] .中國免疫學雜志,2016，32(7):962- 964 .

Li LN,Bi ZB,Wang JS.Preliminary research in relationship between TNFAIP8 and gastric cancer drug resistance[J].Chin J Immunol,2016,32(7):962- 964.

[11] Zhang YH,Yan HQ,Wang F,etal.TIPE2 inhibits TNF- alpha- induced hepatocellular carcinoma cell metastasis via Erk1/2 downregulation and NF- kappaB activation[J].Int J Oncol,2015，46(1):254- 264.

[12] Zhao Q,Zhao M,Dong T,etal.Tumor necrosis factor- alpha- induced protein- 8 like- 2(TIPE2)upregulates p27 to decrease gastic cancer cell proliferation[J].J Cell Biochem,2015，116(6):1121- 1129.

[13] Gottesman MM,Fojo T,Bates SE.Multidrug resistance in cancer:role of ATP- dependent transporters[J].Nat Rev Cancer,2002，2(1):48- 58.

[14] Requenez- Contreras JL,Lopez- Castillejos ES,Hernandez- Flores R,etal.MiR- 138 indirectly regulates the MDR1 promoter by NF- kappaB/p65 silencing[J].Biochem Biophys Res Commun,2017，484(3):648- 655.

[15] Zhao YY,Yu L,Liu BL,etal.Downregulation of P- gp,Ras and p- ERK1/2 contributes to the arsenic trioxide- induced reduction in drug resistance towards doxorubicin in gastric cancer cell lines[J].Mol Med Rep,2015，12(5):7335- 7343.

[16] Yu Z,Sato S,Trackman PC,etal.Blimp1 activation by AP- 1 in human lung cancer cells promotes a migratory phenotype and is inhibited by the lysyl oxidase propeptide[J].PLoS One,2012，7(3):e33287.

[17] Matassa DS,Amoroso MR,Lu H,etal.Oxidative metabolism drives inflammation- induced platinum resistance in human ovarian cancer[J].Cell Death Differ,2016，23(9):1542- 1554.