長鏈非編碼BANCR通過激活Wnt/β- catenin信號通路調控黑色素瘤細胞遷移和侵襲行為①

楊曉靜 孟 瑋 徐宏俊 周向昭

(河北北方學院附屬第一醫院皮膚科,張家口 075000)

黑色素瘤也稱為惡性黑色素瘤，是一種從黑色素細胞發展而來的癌癥[1]。黑色素瘤常見于15～45歲的中青年人，通常發生于皮膚，但偶爾也會出現在口腔、腸道或眼睛[2]。盡管黑色素瘤僅占皮膚惡性腫瘤中4%，但皮膚癌中80%的死亡卻是由其所造成[3]。黑色素瘤的主要特征是病情進展迅速，而且現有的治療效果不理想，患者很快就出現局部淋巴結或者遠處器官的轉移[4]。因此，進一步深入探尋黑色素瘤的發病機制，尋找新的分子靶點顯得尤為重要。

最近，越來越多的人注意到一類稱為長鏈非編碼RNA(lncRNA)的基因產物，它在多種腫瘤的發病和發展中起到重要的作用[5]。lncRNA的長度一般大于200個核苷酸，可在不同生物行為過程中調節基因的轉錄或轉錄后的表達[6]。有證據表明，lncRNA參與了細胞的凋亡和侵襲，能重塑干細胞的多功能性，調節選擇性剪接、染色質重塑和RNA的代謝等[7]。例如，lncRNA HOTAIR能通過增強PRC2調節腫瘤侵襲性，抑制腫瘤的遷徙[8]。而lncRNA H19的高表達與胃癌的發生和轉移密切相關[9]。 PRNCR1和PCGEM1可以調節前列腺癌患者體內雄激素受體的轉錄和表達[10]。

BRAF基因激活的非編碼RNA(BRAF- activated non- coding RNA，BANCR)是位于9號染色體上一個693 bp的 lncRNA，在多種癌癥中有異常的表達，如結腸直腸癌、視網膜母細胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、肺癌、胃癌和肝細胞癌等[11- 16]。

我們期望通過研究BANCR在黑色素瘤患者中的表達水平，探究BANCR對黑色素瘤細胞侵襲和遷移能力的影響及其調控機制，挖掘新的分子標記物，為黑色素瘤的診治提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織樣品采集 收集從2007年1月到2011年1月之間在我院進行的黑色素瘤切除手術的腫瘤組織109例，正常皮膚組織30例。黑色素瘤患者男性58例，女性51例，年齡40～76歲，中位年齡61歲。本研究通過醫院的醫學倫理委員會的同意。黑色素瘤組織經過了醫院病理科組織病理學的證實。切除的腫瘤組織樣本立即放入液氮中冷凍并儲存在-80℃直至RNA提取。

1.1.2細胞株和實驗試劑 黑色素瘤細胞系A101D、A375、B16均購于武漢大學細胞典藏中心。RPMI1640培養液、10%新生小牛血清(FBS)、含100 μg/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的、0.25%胰酶溶液購自Gibco公司,二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。細胞在含有10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養基中培養，37℃在5%CO2培養箱中培養，生長至80%左右濃度時進行傳代和凍存，用于后續的實驗。細胞培養瓶和96孔板購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2方法

1.2.1生存分析 使用Kaplan- Meier生存曲線與Log- rank檢驗對黑色素瘤患者進行生存分析。所有治療結束后，對患者生存預后情況進行定期隨訪(門診隨訪或電話隨訪邀請患者定期來院復查)，隨訪截止時間為2017年3月。生存時間(Suivival time)作為計算患者腫瘤相關生存情況的指標，其定義為從患者初始治療至患者死亡的時間。

1.2.2細胞轉染 實驗使用siRNA轉染誘導BANCR在細胞中的低表達。BANCR siRNA購于上海Genepharma公司，靶序列如下siRNA59- CGGAAATAGACTGCAGCACCAA- 39。并根據制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsb- ad，CA)將其轉染入細胞48 h，獲得相應穩定表達的細胞株。

1.2.3mRNA提取和qPCR試驗 吉瑪基因有限公司設計BANCR引物，forward:ACAGGACTCCATGGCAAACG,reverse:ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT;GAPDH:forward:ACCACAGTCCATGCCATCAC,reve- rse:TCCACCACCCTGTTGCTGTA。EP管中加入700 μl 的lysis buffer。細胞直接收集好后加入其中裂解。Trozel(Gibco)抽提組織總RNA，逆轉錄，PCR擴增BANCR，用GAPDH作為內參物。反應條件：以100 ng總RNA為模板，逆轉錄cDNA，反應條件為：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根據Kapa PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數據以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測蛋白水平 實驗分為兩組:NC組和BANCR- siRNA組，NC組是未做處理的黑色素瘤A375細胞株，BANCR- siRNA是轉染慢病毒后的A375細胞株。按照說明書配制10%SDS- PAGE分離膠，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉法將蛋白至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST充分沖洗后，使用1∶1 000稀釋一抗孵育(兔單克隆β- catenin和c- myc抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記羊抗兔IgG(1∶2 500)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發光。實驗重復3次。

1.2.5劃痕愈合實驗檢測黑素瘤細胞的遷移能力 將兩組細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200 μl消毒槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始距離(0 time)，在恒溫孵箱中孵育72 h后，測量劃痕的距離，并計算細胞的遷移率。細胞遷移率=[D(t=24 h，48 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。實驗重復3次。

1.2.6Transwell侵襲實驗檢測黑素瘤細胞的侵襲能力 所有試劑及器材均于冰塊上預冷處理，將Transwell小室置于24孔板內，將Transwell小室內膜均勻涂抹Matrigel膠100 μl，37℃孵育20 min，逐步消化、離心、計數細胞后，按照2.5×104ml-1用無血清培養基將兩組細胞稀釋，制成細胞懸液；按照每孔200 μl的細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養基500 μl，放入37℃孵箱培養；孵育24 h后使用甲醛固定細胞，結晶紫染色15 min，使用棉簽去除小室內膜上的細胞，然后于顯微鏡下計數，觀察4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數。實驗重復3次。

2 結果

2.1BANCR在黑色素瘤組織和細胞株中的表達 使用qPCR檢測BANCR在組織標本中和黑色素瘤細胞株中的表達情況。如圖1A所示，BANCR在黑色素瘤組織中的mRNA的相對表達量顯著高于正常的皮膚組織(3.10±0.44，P<0.05)。如圖1B所示，在黑色素瘤細胞株A101D、A375、B16中，BANCR的表達均高于正常對照(P<0.05)，而A375細胞的表達最高(3.23±0.14)，且幾種黑色素瘤的生長速度、侵襲及遷移能力相差不明顯，所以我們選擇A375細胞進行下一步功能學實驗。

2.2BANCR與黑色素瘤患者臨床病理特征之間的關系 將109例黑色素瘤腫瘤組織樣本和癌旁正常組織進行臨床病理參數的統計分析。結果發現(如表1所示)，BANCR在不同年齡性別的黑色素瘤患者之間的表達差異不明顯，無統計學意義(P>0.05)。BANCR的表達與黑色素瘤的病理分期及淋巴結是否轉移有關，病理分期越高，BANCR在黑色素瘤組織中表達也就越高(P<0.05)，而在有淋巴結轉移的患者中BANCR的表達也明顯高于未轉移的患者(P<0.05)。

2.3BANCR與黑色素瘤患者生存時間的關系 為了探究BANCR對于黑色素瘤患者的預后價值，使用Kaplan- Meier生存曲線與Log- rank檢驗分析不同BANCR水平的生存時間差異。如圖2所示，BANCR高表達黑色素瘤患者的總生存期顯著低于BANCR低表達者(P<0.01)。BANCR的表達與黑色素瘤患者的生存時間呈負相關。

圖1 BANCR在組織標本和黑色素瘤細胞株中的表達Fig.1 Expression of BANCR in different tissues and melanoma cell linesNote: *.P<0.05.

表1BANCR的表達與黑色素瘤患者臨床病理特征之間的關系

Tab.1RelationshipbetweenexpressionofBANCRandclinicopathologicalfeaturesofmelanomapatients

ClinicopathologicaldataNumberHighexpressionofBANCRLowexpressionofBANCRχ2valuePvalueGender1.5720.210Male583226Female512229Age(years)0.0050.944≤6043271660664125Pathologicalstaging10.4580.015Ⅰ1275Ⅱ211011Ⅲ594613Ⅳ17152Lymphnodemetastasis11.4500.001No351817Yes746113

圖2 BANCR與黑色素瘤患者生存時間的關系Fig.2 Relationship between survival time of BANCR and melanoma patients

圖3 BANCR對A375細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effects of BANCR on invasion ability of A375 cellsNote: *.P<0.05.

2.4BANCR對A375細胞侵襲能力的影響 使用siRNA將A375的BANCR進行下調。Transwell實驗結果如圖3所示，BANCR- siRNA組通過Matrigel基質膠的細胞數量為(98.54±5.21)，明顯少于對照組(423.34±10.72)，差異有統計學意義(P<0.05)。該結果說明抑制BANCR的表達可以減弱A375細胞的侵襲能力。

2.5BANCR對A375細胞遷移能力的影響 劃痕愈合實驗結果如圖4所示，在熒光顯微鏡下觀察測量兩組細胞任意三個部位的劃痕寬度，計算相應的遷移率，公式如下：遷移率=[D(t=24 h，48 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。結果表明，BANCR- siRNA組細胞的遷移速率明顯低于對照組，兩組在24 h和 48 h 的遷移率分別為(25.61±7.37)% vs (46.92±9.48)%,P<0.05；(31.25±12.75)% vs (72.19±12.23)%,P<0.05。A375細胞的遷移能力隨BANCR的表達降低而降低。

2.6下調BANCR后對Wnt/β- catenin信號通路的影響 Western blot結果顯示(圖5)：與NC組相比，BANCR- siRNA組中β- catenin和c- myc蛋白表達水平明顯下降[(1.25±0.18)vs (2.45±0.09);(1.34±0.23)vs (3.17±0.11),P<0.05]；表明下調BANCR可以影響Wnt/β- catenin信號通路的表達。

圖4 BANCR對A375細胞遷移能力的影響Fig.4 Effects of BANCR on migration ability of A375 cellsNote: *.P<0.05.

圖5 BANCR對β- catenin和c- myc蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of BANCR on protein expression levels of β- catenin and c- mycNote: *.P<0.05.

3 討論

黑色素瘤的主要原因是紫外線暴露于皮膚色素含量較低的人群，通常白人的發病率高于其他有色人種[17]，而且黑色素瘤的發病風險隨著年齡的增長而增加，診斷時的平均年齡約為60歲[18]。在全球范圍內，2012年新發的黑色素瘤約有23.2萬人，2015年有310萬患有活動性疾病，導致59 800人死亡[19]。來自歐洲，加拿大和美國的流行病學數據顯示，過去幾十年黑色素瘤的發病率持續增長[20]。新西蘭發病率最高，每10萬人50例[21]。

對于早期的黑色素瘤，活檢確診后，通常進行廣泛的腫瘤切除[22]。除此之外，還可以根據患者的病理分期，選擇性地采取前哨淋巴結活檢[23]。而對于晚期黑色素瘤的治療則是從多學科的方法進行的。近年來隨著靶向治療的發展，黑色素瘤患者的生存預后有著顯著的改善[24]。特別是免疫療法已經成為除了手術，化療和放射治療之外，治療轉移性黑色素瘤的主要方式[25]。2011年6月，一項由ipilimu- mab與達卡巴嗪聯合治療晚期黑色素瘤的臨床試驗表明，患者的中位生存期從9個月增加到11個月[26]。盡管生存時間有所改善，但與我們預期的仍有一定距離。所以對于黑色素瘤患者，特別是晚期的患者，我們仍需要繼續尋找更高效的治療靶點。

BANCR最早是由Nicola和Ross通過RNA- seq對致癌基因BRAFV600E表達影響的轉錄物進行篩選而首次被發現[27]。Guo等[11]研究表明顯示，BAN CR在結腸直腸癌中高度表達，BANCR表達增加與臨床分期和淋巴結轉移相關。此外，BANCR通過MEK/ERK途徑誘導上皮間質轉化來促進子宮內膜癌的遷移[28]。而在胃癌中，BANCR通過滅活P38和JNK MAPK促進癌細胞的增殖和遷移，而高BANCR水平與臨床分期，腫瘤深度，淋巴結和遠處轉移、預后呈正相關[15]。BANCR表達增加還是視網膜母細胞瘤患者預后差的獨立危險因素，BANCR的下調顯著抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖、遷移和體外侵襲[12]。我們的結果也證實，BANCR與黑色素瘤的遷移能力和侵襲能力密切相關。而且BANCR的表達與黑色素瘤患者的臨床病理特征也存在一定聯系，淋巴結轉移和較高的病理分期往往都存在有高表達的BANCR。患者的生存時間也隨BANCR的升高而降低。

Wnt信號通路對黑色素細胞的發育至關重要，它可以指導黑色素細胞遷移到表皮和毛囊，并促進其分化，有助于皮膚毛發的色素形成[29]。而Wnt信號通路蛋白過量表達會導致黑色素細胞數量的增加。相反，Wnt- 1和Wnt- 3a基因的缺失會導致Wnt信號活性的喪失，從而導致黑色素細胞的減少[30]。

蛋白質Wnt家族可以通過三個關鍵介質介導的三種不同途徑發出信號：β- 連環蛋白(典型的Wnt信號通路)，JNK(平面細胞極性通路)和PKC /Ca2+(非典型的Wnt信號通路)[31]。事實上越來越多的證據表明，黑色素瘤中Wnt調節的二分體表型歸因于由不同Wnt家族成員刺激的典型和非典型軸之間的相互作用[32]。按照目前的理解是，黑色素瘤細胞的生長和轉化是通過典型的Wnt信號通路，而轉移則通過非典型Wnt信號通路[33]。我們的研究也發現下調BANCR后，對Wnt/β- catenin信號通路起到一定的抑制作用，下游的β- catenin和c- myc表達明顯降低。

綜上所述，長鏈非編碼BANCR在黑色素瘤患者中普遍存在高表達，而且與患者生存時間呈負相關，同時它也能通過激活Wnt/β- catenin信號通路調控黑色素瘤細胞遷移和侵襲行為。

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