下調SLP- 2基因表達抑制腦膠質瘤細胞增殖及誘導凋亡的機制研究

陳小忠 王 培 謝明祥 趙洪新 吳海濤

(遵義醫學院附屬醫院神經外科,遵義 563003)

腦膠質瘤是常見的起源于神經外胚層的中樞神經系統惡性腫瘤，約占顱內腫瘤的45%，具有復發率高、病死率高及治愈率低等特性，手術治療無法根治且對常規使用的化放療藥物不敏感，預后很差[1]。腫瘤的發生是一個多階段、多因素的過程，包括抑癌基因、癌基因、DNA損傷修復基因的表觀遺傳變異及突變。研究膠質瘤發生及發展的生物學特性、分子機制對該病的診斷及治療具有重要意義。人的 Stomatin like protein 2(SLP- 2)基因定位于9p13.1，是2000年首次發現并命名的一個新基因，SLP- 2蛋白被認為是一種細胞膜相關蛋白[2]。已有研究顯示，SLP- 2基因在前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤中存在高表達[3,4]，將SLP- 2的反義基因導入甲狀腺癌、食管鱗癌等腫瘤可促進癌細胞的惡性生長及增殖，并參與癌癥的轉移[5,6]。有研究顯示SLP- 2基因在腦膠質瘤也有高表達，但對腦膠質瘤細胞的生物學特性研究尚未清楚。本研究中通過RNA干擾技術沉默腦膠質瘤細胞中SLP- 2基因表達，觀察細胞增殖和凋亡變化，并研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人腦膠質瘤SHG44細胞株購自上海生命科學研究院細胞庫；胎牛血清、RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自大連TaKaRa公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、CCK8試劑盒、膜聯蛋白V- FITC(Annexin V- FITC)/碘化丙錠(PI)試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；SLP- 2、B細胞淋巴瘤/白血病- 2(B cell lymphoma/leukemia- 2，Bcl- 2)、Bcl- 2相關X蛋白(Bcl- 2 associated X protein,Bax)、Notch1、Hes1、GAPDH抗體均購自美國Abcam公司；酶標儀、流式細胞儀均購自美國Bio- Rad公司；熒光定量PCR儀購自美國Bioneer。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 人腦膠質瘤U251細胞在37℃，體積分數為5%CO2，95%飽和濕度的培養箱中用含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養基(100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素)傳代培養。取對數生長期的細胞用于實驗研究。細胞分為空白組(細胞未做任何處理)、陰性對照組(細胞轉染無義siRNA序列)和SLP- 2敲低組(細胞中轉染SLP- 2的靶向siRNA序列)。轉染前1天以1×106個/孔濃度接種于6孔細胞培養板中，每孔加入2 ml，細胞生長達到80%融合度以上時進行轉染，轉染參照LipofectamineTM2000轉染說明進行操作。

1.2.2蛋白質印跡(Western blot) 取上述轉染48 h 的細胞，加入適量的細胞裂解液提取細胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測提取的蛋白濃度，蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶5比例充分混勻，100℃變性5 min，每泳道30 μg蛋白樣品，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離，電泳后轉移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉溶液封閉過夜，加入一抗(SLP- 2、Bcl- 2、Bax、Notch1、Hes1抗體均按照1∶500稀釋，GAPDH按照1∶1 000稀釋)，4℃過夜，洗膜后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗，37℃孵育2 h，增強型化學法(ECL)發光顯色，X線片曝光，顯影，定影。

1.2.3細胞增殖檢測 U251細胞以每孔2×104個細胞(100 μl)接種于96孔細胞培養板上，置于37℃，體積分數5%CO2的培養箱中培養24 h進行同步化處理，按照上述分組進行轉染，收集轉染48 h的各組細胞，每孔細胞中加入CCK8溶液10 μl，培養板置于培養箱內孵育2 h，以不加細胞只加培養液的空白對照孔調零，酶標儀檢測570 nm吸光度(A)，記錄結果，實驗重復3次。計算細胞增殖率。細胞增殖率=(轉染組細胞A/對照組細胞A)×100%。

1.2.4細胞凋亡檢測 采用Annexin V- FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。取轉染后培養48 h的上述三組細胞，胰蛋白酶消化細胞，預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞2次，細胞濃度調整為1×106個/ml，Binding Buffer懸浮細胞，按照細胞凋亡試劑盒的操作說明檢測各組細胞的凋亡情況。

1.2.5IL- 6、TNF- α的mRNA表達檢測 RNA提取試劑盒提取轉染48 h的三組細胞中的總RNA，逆轉錄成cDNA，以GAPDH作為內參基因，cDNA為模板，按照試劑盒的操作說明擴增IL- 6、TNF- α基因。IL- 6、TNF- α的引物序列如下:IL- 6 F：5′- AGTTGTGCAATGGCAATTCTG- 3′，R：5′- AGGACTCTGGCTTTGTCTTTC- 3′。TNF- α F：5′- ACTGGCGTGTTCATCC- GTTCT- 3′，R：5′- CGCAATCCAGGCCACTACTTC- 3′。GAPDH F：5′- ATGACCCCTTCATTGACC- 3′，R：5′- GAAGATGGTGATGGGATTTC- 3′。所有引物由上海生工合成。實驗數據(Ct值)采用2-ΔΔCt法進行統計。

2 結果

2.1下調 SLP- 2表達的效果 空白組、陰性對照組、SLP- 2敲低組SLP- 2的蛋白表達分別為(0.622±0.047)、(0.628±0.046)、(0.087±0.011)，陰性對照組SLP- 2的蛋白表達與空白組差異無統計學意義(t=0.158，P=0.882)，而SLP- 2敲低組SLP- 2的蛋白表達顯著低于空白組(t=19.197，P=0.000)。見圖1。

2.2下調 SLP- 2表達抑制細胞增殖 空白組、陰性對照組、SLP- 2敲低組細胞存活率分別為(100.00±2.23)%、(95.86±2.12)%、(70.54±3.98)%，陰性對照組細胞存活率與空白組差異無統計學意義(t=2.331，P=0.080)，SLP- 2敲低組細胞存活率顯著低于空白組(t=11.185，P=0.000)。見圖2。

2.3下調 SLP- 2表達促進細胞凋亡 空白組、陰性對照組、SLP- 2敲低組細胞凋亡率分別為(1.72±0.48)%、 (1.74±0.50)%、 (17.13±1.32)%，陰性對照組細胞凋亡率與空白組差異無統計學意義(t=0.050，P=0.963)，SLP- 2敲低組細胞凋亡率顯著高于空白組(t=19.003，P=0.000)。見圖3。

圖1 下調 SLP- 2表達的效果Fig.1 Effect of SLP- 2 down expressionNote: A.Western blot was used to detect the expression of SLP- 2 protein after transfection;B.The relative expression of SLP- 2 protein in each group cells;compared with the blank group,*.P<0.05.

圖2 下調 SLP- 2表達對細胞增殖的影響Fig.2 Effect of SLP- 2 down expression on cell proliferationNote: Compared with the blank group,*.P<0.05.

圖3 下調 SLP- 2表達對細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of SLP- 2 down expression on cell apoptosisNote: A.The apoptosis of each group cell was detected by flow cytometry;B.The apoptosis rate in each group;compared with the blank group,*.P<0.05.

2.4下調 SLP- 2表達對IL- 6、TNF- α表達的影響 RT- PCR檢測IL- 6、TNF- α的mRNA表達，結果顯示，陰性對照組IL- 6、TNF- α的mRNA表達與空白組差異無統計學意義(IL- 6t=0.312，P=0.770；TNF- αt=0.076，P=0.943)，SLP- 2敲低組IL- 6、TNF- α的mRNA表達均顯著低于空白組(IL- 6t=10.808，P=0.000；TNF- αt=10.072，P=0.001)。見表1。

2.5下調 SLP- 2表達對Bcl- 2、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達的影響 Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl- 2、Bax及Notch1和靶基因Hes1的蛋白表達，結果顯示，空白組、陰性對照組、SLP- 2敲低組Bax的蛋白表達分別為(0.072±0.009)、(0.063±0.009)、(0.282±0.031)，Bcl- 2蛋白表達分別為(0.315±0.032)、(0.309±0.031)、(0.192±0.027)，Notch1的蛋白表達分別為(0.711±0.048)、(0.704±0.051)、(0.112±0.014)，Hes1的蛋白表達分別為(0.342±0.028)、(0.350±0.026)、(0.047±0.007)，陰性對照組Bax、Bcl- 2、Notch1、Hes1蛋白表達與空白組差異無統計學意義(Baxt=0.817，P=0.460；Bcl- 2t=0.233，P=0.827；Notch1t=0.173，P=0.871；Hes1t=0.363，P=0.735)，SLP- 2敲低組Bcl- 2、Notch1、Hes1蛋白表達顯著低于空白組，Bax蛋白表達顯著高于空白組(Bcl- 2t=5.088，P=0.007；Notch1t=20.75，P=0.000；Hes1t=17.704，P=0.000；Baxt=17.331，P=0.000)。見圖4。

表1下調SLP-2表達對IL-6、TNF-α表達的影響

Tab.1EffectofSLP-2downexpressiononIL-6andTNF-αexpression

GroupsmRNArelativeexpressionIL-6TNF-αBlankgroup1.000±0.1221.000±0.105NCgroup0.972±0.0961.006±0.089SLP-2knockdowngroup0.213±0.0321)0.365±0.0301)

Note：Compared with the blank group,1)P<0.05.

圖4 下調 SLP- 2表達對Bcl- 2、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of SLP- 2 down expression on Bcl- 2,Bax,Notch1,Hes1 protein expressionNote: A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of protein;compared with the blank group,*.P<0.05.

3 討論

腦膠質瘤具有易復發及侵襲性的特性，由于其生長部位的特殊性，手術及放化療藥物均很難達到預期效果，而使腦膠質瘤成為神經系統難以治療的疾病之一[7]。隨著分子生物學的不斷發展，多種腫瘤的生物標記物在腫瘤防治中被應用。SLP- 2基因屬于Stomatin基因超家族成員，在人類的多種組織中都有表達，近些年來，通過蛋白組學和基因組學發現SLP- 2在多種腫瘤中表達上調，影響癌細胞的增殖、凋亡、遷移等生物學過程，被認為是一種新的腫瘤相關基因[8,9]。但關于SLP- 2對惡性腫瘤關系的報道較少。有研究顯示，RNA干擾抑制胃癌細胞中SLP- 2基因的表達可降低癌細胞的增殖及阻滯細胞于G1期[10]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA誘導的能使特異mRNA序列降解的現象，具有高效性、特異性等特點，是近些年來發現和發展起來的基因阻斷技術，該技術可有效地沉默腫瘤相關基因表達、促進癌細胞凋亡、抗血管生成等，且與傳統的放化療結合，更具抗癌潛力[11,12]。本研究結果顯示，RNA干擾抑制腦膠質瘤細胞中SLP- 2表達后細胞增殖顯著降低，凋亡增加，炎癥細胞因子IL- 6和TNF- α表達下調。Bcl- 2蛋白顯著下調表達，Bax蛋白顯著上調表達。細胞的凋亡是由多個因子和因素控制的，Bcl- 2家族在細胞凋亡過程中發揮重要作用。Bcl- 2是Bcl- 2家族的抑凋亡基因，Bax是Bcl- 2家族的促凋亡基因，兩者之間可形成同源二聚體和異源二聚體[13,14]。有研究指出，細胞的凋亡取決于Bax和Bcl- 2的比率，Bcl- 2的表達下降，而同時Bax的表達上升，發揮促細胞凋亡的作用，反之則抑制細胞的凋亡[15]。

Notch信號通路由Notch受體和配體、下游效應物、DNA結合蛋白組成，在進化上非常保守，可從多個方面對細胞的增殖、凋亡、機體發育等進行調控，影響細胞命運[16]。Notch1是Notch的一個受體，大量研究顯示，在多種腫瘤中Notch1信號通路處于異常激活狀態，如肺癌、腦膠質瘤等，其異常表達可通過直接或間接的作用誘導腫瘤的發生[17，18]。有研究指出，抑制腦膠質瘤細胞中Notch1信號通路可降低癌細胞的增殖及誘導細胞的凋亡[19]。Hes1是Notch1信號通路下游重要的效應分子，是其是否激活的標志。本研究檢測Notch1、Hes1的蛋白表達，結果顯示，抑制SLP- 2基因的表達后腦膠質瘤細胞中Notch1、Hes1蛋白顯著下調表達。這說明抑制SLP- 2基因的表達可通過下調Notch1信號通路降低腦膠質瘤的發生發展。

綜上所述，抑制腦膠質瘤細胞中SLP- 2基因的表達后可通過下調Notch1信號通路降低癌細胞的增殖及誘導凋亡，降低炎癥細胞因子IL- 6和TNF- α表達。本研究初步證實了SLP- 2基因在腦膠質瘤發生及發展中的作用，為尋找腦膠質瘤的基因治療靶點提供了一定的理論基礎。

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