旋毛蟲對不同腸炎模型小鼠脾臟淋巴細胞Th1/Th2水平的影響①

趙 穎 王紅月 竇海川 肖慶飛 趙悅竹 顧春梅④

(吉林大學第一醫(yī)院人獸共患病教育部重點實驗室，長春 130062)

蠕蟲(多細胞寄生蟲)與他們的脊椎動物適應性共生和進化已達數億年或更久，且不言而喻的多以丑陋骯臟、危害宿主健康的面目出現。但隨著“衛(wèi)生假說”的提出，近年來越來越多的研究顯示寄生蟲尤其蠕蟲可有效預防和治療日益嚴重的免疫失衡性疾病[1]。在保護生物學多樣性層面，在一定程度上更印證了黑格爾“凡是存在的即是合理的”，即寄生蟲在造成危害的同時給機體帶來了意想不到的益處，并預言對寄生蟲的利用可能比防治具有同等或更具前景和誘惑力。

蠕蟲中的旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis，T.spiralis)作用部位直接起源于腸道，最終定植于肌肉。因此，腸道局部乃至全身的免疫反應都與旋毛蟲分泌的許多天然的有益抗原物質關系密切。

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)主要包括克羅恩病(Crohn′s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)[2,3]。它們是一種典型的腸道黏膜免疫失衡性疾病，呈慢性病程，并且易反復發(fā)作，為頑固難治的消化道疾病。免疫反應紊亂是IBD重要發(fā)病原因之一，以腸黏膜的炎癥和損傷為主要特征，并伴隨腸內外的一些自身免疫性反應。患者進一步發(fā)展為結直腸癌的風險是正常人的6倍，并且惡變率很高。在中國，迅猛發(fā)展的經濟和逐漸提高的衛(wèi)生狀況，使IBD的發(fā)病率也在逐年增長[4]。基于“衛(wèi)生假說”中腸道蠕蟲與IBD的關聯性[5,6]，一直以來，我們的研究團隊開展了關于旋毛蟲作為生物免疫調節(jié)劑防治炎癥性腸病的多項研究。結果，預先感染旋毛蟲對三硝基苯磺酸(Trinitrobenzesulfonic,TNBS)模型小鼠的腸道具有保護作用[7]，本研究擬通過旋毛蟲對TNBS和噁唑酮(Oxazolone,OXZ)誘導的兩種不同IBD小鼠模型進行對比干預，應用流式細胞技術(Flow cytometry，FCM)在單個細胞水平上探討T.spiralis對腸炎小鼠(TNBS、OXZ誘導)脾臟Th1/Th2表達的影響。更深一步探討旋毛蟲防治IBD的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 旋毛蟲的收集與攻蟲：消化保種小鼠(本實驗室)的肌肉組織，將獲得的肌幼蟲(經洗滌、計數)，經口攻擊感染實驗小鼠。

1.2方法

1.2.1造模方法及實驗分組 雌性BALB/c小鼠6～8周齡，體重20～25 g，購于長春生物制品所。TNBS結腸炎模型的建立，依據Stallmach等[8]方法。隨機將實驗小鼠分為三組，A1為對照組(50%乙醇)，B1為模型組(TNBS誘導，購于Sigma公司)，C1為干預組(預先感染T.spiralis后誘導TNBS模型)，保證取材時每組有6只以上小鼠。OXZ結腸炎模型的建立，依據Heller等[9]方法。同樣隨機將實驗小鼠分為三組，A2為對照組(50%乙醇)，B2為模型組(OXZ誘導，購于Sigma公司)，C2為干預組(預先感染T.spiralis后誘導OXZ模型)，(保證取材時每組有6只以上小鼠)。實驗開始，經口感染T.spiralis400條/只(C1、C2組)，接種21 d后，分別給予50%乙醇灌腸(A1、A2組)和TNBS造模(2 mg TNBS溶液150 μl直腸灌注)(B1及C1組)，B2及C2組給予OXZ造模(1%OXZ溶液150 μl直腸灌注，在直腸灌注藥液前5 d先予3%OXZ無水乙醇溶液皮膚致敏)，造模后(TNBS、OXZ)分批處死小鼠(第3、7天)，取材檢測各項指標。

1.2.2成功感染旋毛蟲的判定 小鼠取材后，取感染旋毛蟲組小鼠膈肌，于顯微鏡下觀察，發(fā)現肌肉蟲則表明成功感染，并計算感染率及蟲體寄生密度。

1.2.3分離小鼠脾臟淋巴細胞 處死小鼠，打開左側腹部皮膚，小心分離皮下組織和腹部肌肉暴露出脾臟，提起，剪去周圍結締組織，將脾臟放入離心管中剪碎，將200目鋼網置于六孔板上，用注射器頭研磨成單個細胞，收集于離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清，加入5 ml溶血劑混懸沉淀，室溫靜置10 min，再1 000 r/min離心10 min，PBS沖洗，調成濃度為1×106ml-1的細胞懸液。

1.2.4脾臟淋巴細胞Th1/Th2表達水平(流式細胞儀) 首先收獲細胞，在脾臟淋巴細胞中加入刺激劑和蛋白轉運抑制劑(2.5 μl 50 ng/ml PMA、10 μl 1 μg/ml A23187、10 μl 10 μg/ml BFA)，混勻后，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。之后，加入20 μl FITC標記的anti- CD3和20 μl PE/Cy5標記的anti- CD8進行細胞表面染色，混勻，室溫暗處孵育15 min，離心500 r/min 5 min，棄上清。隨后進行固定和破膜，加入0.5 ml的固定劑室溫暗處孵育15 min，加入PBS，離心500 r/min 5 min，棄上清；加入1 ml 的破膜劑室溫暗處孵育10 min，加PBS洗液，離心500 r/min 5 min，棄上清。最后進行細胞內染色，加入熒光素標記抗體IFN- γ- PE、IL- 4- PE，混勻，室溫暗處孵育30 min。加洗液，離心500 r/min 5 min，棄上清，加入0.5 ml PBS重懸細胞上機檢測。經488 nm氬離子激光激發(fā)后，在波長530 nm處，抗CD3+單克隆抗體發(fā)綠色熒光；在波長670 nm處，抗CD8+單克隆抗體發(fā)深紅色熒光；在波長570 nm處，IFN- γ單克隆抗體及IL- 4單克隆抗體發(fā)桔黃色熒光。

數據分析：用FLOW CHECK標準微球校準流路和光路，利用標準補償，作好FITC、PE、PE/Cy5之間的熒光補償。以CD3- SSC設門，圈定CD3+淋巴細胞。以CD8、IFN- γ和IL- 4分別建立雙參數點圖對圈定的CD3+淋巴細胞進行分析。得出Th1(CD3+CD8-IFN- γ+)和Th2(CD3+CD8-IL- 4+)的百分比。

2 結果

2.1成功感染旋毛蟲的判定 分批處死小鼠取材后，取感染旋毛蟲組小鼠膈肌，于顯微鏡下觀察，發(fā)現肌肉蟲則表明成功感染，并計算感染率及蟲體寄生密度。本實驗攻蟲組小鼠膈肌中蟲體寄生密度1 500～2 000條/g。感染成功率為100%。

2.2T.spiralis對TNBS誘導IBD小鼠脾臟淋巴細胞Th1/Th2平衡的影響 與單純造模組相比，預先感染T.spiralis后造模第3天及第7天CD3+CD8-IFN- γ+的Th1細胞百分比未見明顯變化(P>0.05)，CD3+CD8-IL- 4+的Th2細胞百分比在造模后第3天也無差異(P>0.05)，第7天CD3+CD8-IL- 4+的Th2細胞百分比高于模型組(P<0.05)。與模型組相比，T.spiralis感染小鼠后造模第3天Th1/Th2比值未見明顯下降(P>0.05)，第7天Th1/Th2比值明顯下降(P<0.05)。見圖1、2，表1、2 。

2.3T.spiralis對OXZ誘導IBD小鼠脾臟淋巴細胞Th1/Th2平衡的影響 與單純造模組相比，預先感染T.spiralis后造模第3天及第7天小鼠脾臟CD3+CD8-IFN- γ+的Th1細胞百分比明顯升高(P<0.05)，CD3+CD8-IL- 4+的Th2細胞百分比未見明顯變化(P>0.05)，預先感染T.spiralis小鼠造模后第3天及第7天脾臟Th1/Th2比值與模型組相比均明顯升高(P<0.05)。見圖3、4，表3、4。

圖1 TNBS造模3 d小鼠脾臟淋巴細胞百分比Fig.1 Percentage of splenic lymph cells of mouse 3 days after administration of TNBSNote: A. Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 3 days after administration of TNBS；B. Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 3 days after administration of TNBS；C. Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T. spiralis- infected mouse 3 days after administration of TNBS；D. Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T. spiralis- infected mouse 3 days after administration of TNBS.

圖2 TNBS造模7 d小鼠脾臟淋巴細胞百分比Fig.2 Percentage of splenic lymph cells of mouse 7 days after administration of TNBSNote: A.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 7 days after administration of TNBS；B.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 7 days after administration of TNBS；C.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of TNBS；D.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of TNBS.

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol5.21±1.391.40±0.764.07±1.43TNBS8.72±2.461)1.48±0.405.90±1.121)T.spiralis+TNBS7.96±1.571)1.72±0.745.83±4.181)

Note：Vs 50% Ethanol group,1)P<0.05.

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol3.01±0.651.73±0.382.49±1.54TNBS4.89±1.592)0.98±0.455.89±2.292)T.spiralis+TNBS3.80±0.902.11±0.911)2.89±2.671)

Note：Vs TNBS group,1)P<0.05；vs 50% Ethanol group,2)P<0.05.

圖3 OXZ造模3 d小鼠脾臟淋巴細胞百分比Fig.3 Percentage of splenic lymph cells of mouse 3 days after administration of OXZNote: A.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 3 days after administration of OXZ；B.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 3 days after administration of OXZ；C.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 3 days after administration of OXZ；D.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 3 days after administration of OXZ.

圖4 OXZ造模7 d小鼠脾臟淋巴細胞百分比Fig.4 Percentage of splenic lymph cells of mouse 7 days after administration of OXZNote: A.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+lymph cells of mouse 7 days after administration of OXZ.；B.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of mouse 7 days after administration of OXZ；C.Percentage of splenic CD3+CD8-IFN- γ+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of OXZ；D.Percentage of splenic CD3+CD8-IL- 4+ lymph cells of T.spiralis- infected mouse 7 days after administration of OXZ.

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol5.21±1.391.40±0.764.07±1.43OXZ3.60±1.122)3.74±0.812)0.79±0.522)T.spiralis+OXZ8.45±1.851)2)3.61±0.692)2.98±0.781)2)

Note：Vs OXZ group,1)P<0.05；vs 50% Ethanol group,2)P<0.05.

Tab.4RatiosofTh1lymphcellscomparedtoTh2lymphcellson7daysafteradministrationofOXZ(n=6,

GroupsCD3+CD8-IFN-γ+(Th1,%)CD3+CD8-IL-4+(Th2,%)Th1/Th250%Ethanol3.01±0.651.73±0.382.01±0.84OXZ3.35±1.052.85±0.872)1.14±0.672)T.spiralis+OXZ8.54±1.631)2)2.51±0.793.32±1.561)2)

Note：Vs OXZ group,1)P<0.05；vs 50% Ethanol group,2)P<0.05.

3 討論

旋毛蟲屬于蠕蟲中的線蟲，是一種人獸共患的寄生蟲，肌幼蟲經口進入人體腸道后，感染性肌幼蟲6 h即侵入宿主腸黏膜，寄生于多細胞內龕，由一排柱狀上皮細胞組成，完成蛻皮僅需要30 h，之后發(fā)育為成蟲，性成熟的雌蟲和雄蟲立即進行交配，產生的新生幼蟲(在感染后第4～5天開始)經腸黏膜淋巴管或小靜脈，在宿主全身各組織器官進行移行。約35 d左右完全定植在肌肉，成為感染性肌幼蟲。散在地分布于全球，以溫、熱帶地區(qū)為主，在蠕蟲中是產生免疫抑制作用最強的寄生蟲之一，宿主感染旋毛蟲后產生以Th2型為主的免疫反應[10,11]。

因T.spiralis的作用部位直接起源于腸道，最終定植于肌肉，因此，腸道局部乃至全身的免疫反應都與旋毛蟲分泌的許多天然的有益抗原物質關系密切。

寄生蟲對IBD的中樞免疫細胞T細胞有哪些影響呢？

許多研究表明，以Th1為主的免疫應答過度反應常常發(fā)生在大多數IBD模型動物中，尤其在TNBS模型的免疫反應中占主導作用[12]，類似于人類CD[13]。OXZ誘導的腸炎模型往往具有UC的病理特征[14]，主要由Th2型細胞介導。Th1和Th2在介導機體免疫應答過程中扮演著不同的角色，于分化和功能上相互制約，維持機體免疫平衡。兩個亞群的劃分基于CD4+T細胞分泌的不同細胞因子和介導的免疫功能，如IFN- γ、IL- 12、TNF- α等細胞因子的表達及其功能多代表Th1細胞亞群，IL- 4和IL- 5、IL- 13的表達多代表Th2細胞亞群[15]。任一種細胞亞群的過度免疫反應都會產生相應的疾病。正因此，TNBS模型和OXZ模型基線Th1/Th2反應有明顯差異。另外，具有優(yōu)勢調節(jié)作用的T細胞還包括Th3、Tr1細胞亞型，它們分別產生的TGF- β和IL- 10，都能抑制Th1和 Th2炎癥免疫反應。

我們的前期研究表明[7]，小鼠感染T.spiralis后更易耐受化學誘導劑TNBS對結腸的損傷，T.spiralis主要是抑制了結腸炎小鼠Th1型過度免疫反應使Th1/Th2達到平衡，從分子和蛋白水平我們了解其干預作用可能是通過誘導Th2型免疫反應及Tr1型細胞因子而實現的。相比之下，感染T.spiralis未對小鼠在OXZ造模時起到保護作用，仍然出現了結腸損傷，但沒有按預想的加重腸炎，也就是說，基于Th1和Th2相互制約的理論，感染T.spiralis所產生的Th2型免疫反應可能會對OXZ誘導的Th2型炎癥反應起疊加作用而加重病情[16]。

本實驗在原有研究基礎上，通過流式細胞技術，刺激脾臟淋巴細胞后行熒光染色，在單個細胞水平上動態(tài)檢測細胞內因子和表面抗原的表達，更進一步對比研究了T.spiralis對兩種腸炎小鼠(TNBS、OXZ誘導)Th1/Th2偏移的影響。結果顯示，與TNBS模型組相比，預先感染T.spiralis的小鼠在誘導TNBS腸炎第7天Th1/Th2比值明顯下降，具有統計學意義。與OXZ模型組相比，預先感染T.spiralis的小鼠在誘導OXZ腸炎第3、7天Th1/Th2比值均明顯上調，出現新的偏移，而并非是按理論所設想的T.spiralis增加了OXZ模型原有的Th2為主的免疫反應。經研究分析，可能是針對OXZ腸炎模型T.spiralis誘生出過量的IL- 10。曾有研究人員指出，由于過高濃度的IL- 10反而會激發(fā)淋巴細胞產生IFN- γ，從而使IL- 10的抗炎作用受到抑制，因此靜脈應用大劑量IL- 10時反而降低了其抗炎效果[17]。正是Th1/Th2比值的上調，提示我們，感染T.spiralis使OXZ腸炎小鼠Th1/Th2出現了新的偏移，弱化了Th2表達，因此不足以加重腸道炎癥。通過FCM，我們從細胞水平驗證了既往的研究結論，為T.spiralis干預IBD的后續(xù)研究提供了更詳實的理論依據。對今后進行提取有效抗原蛋白和無害旋毛蟲防治IBD的研究奠定堅實的實驗基礎。

[1] Nascimento Santos L,Carvalho Pacheco LG,Silva Pinheiro C,etal.Recombinant proteins of helminths with immunoregulatory properties and their possible therapeutic use [J].Acta Trop,2017，166:202- 211.

[2] Blumberg RS,Strober W.Prospects for research in inflammatory bowel disease [J].JAMA,2001,285(5):643- 647.

[3] Braegger CP,Macdonald TT.Immune mechanisms in chronic inflammatory bowel disease [J].Ann Allergy,1994,72(2):135- 141.

[4] Li X,Song P,Li J,etal.The disease burden and clinical characteristics of inflammatory bowel disease in the chinese population:a systematic review and meta- analysis [J].Int J Environ Res Public Health,2017，14(3)：pii:E238.

[5] Elliott DE,Urban JF JR,Argo CK,etal.Does failure to acquire hel minth parasites predispose to Crohn′s disease?[J].FASEB J,2000,14(12):1848- 1855.

[6] Varyani F,Fleming JO,Maizels RM.Helminths in the gastrointestinal tract as modulators of immunity and pathology [J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2017，312(6)：G537- G549.

[7] 趙 穎，楊世忠，鄒洪斌,等.旋毛蟲對三硝基苯磺酸誘導的實驗性小鼠腸炎模型的干預研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2007,27(6):509- 512.

Zhao Y,Yang SZ,Zou HP，etal.Trichinella spiralis infection protects mice from TNBS- induced colitis[J].Chin J Microbiol Immunol,2007,27(6):509- 512.

[8] Stallmach A,Marth T,Weiss B,etal.An interleukin 12 p40- IgG2b fusion protein abrogates T cell mediated inflammation:anti- inflammatory activity in Crohn′s disease and experimental colitis in vivo [J].Gut,2004,53:339- 345.

[9] Heller F,Fuss IJ,Nieuwenhuis EE,etal.Oxazolone colitis,a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis,is mediated by IL- 13- producing NK- T cells [J].Immunity,2002,17(5):629- 638.

[10] Else KJ,Finkelman FD.Intestinal nematode parasites,cytokines and effector mechanisms [J].Int J Parasitol,1998，28(8):1145- 1158.

[11] Cvetkovic J,Sofronic- Milosavljevic L,Ilic N,etal.Immunomodulatory potential of particular Trichinella spiralis muscle larvae excretory- secretory components [J].Int J Parasitol,2016，46(13- 14):833- 842.

[12] 王 開，裴志花，胡桂學,等.腸炎動物模型的研究進展[J].中國免疫學雜志,2015,31(5):704- 706.

Wang K,Pei ZH,Hu GX,etal.Advances in animal models of enteritis[J].Chin J Immunol ,2015,31(5):704- 706.

[13] Elson CO,Beagley KW,Sharmanov AT,etal.Hapten- induced model of murine inflammatory bowel disease.Mucosal immune responses and protection by tolerance [J].J Immunol,1996，157(5):2174- 2185.

[14] Boirivant M,Fuss IJ,Chu A,etal.Oxazolone colitis:a murine model of t helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4 [J].J Exp Med,1998,188(10):1929- 1939.

[15] Murphy KM,Reiner SL.The lineage decisions of helper T cells [J].Nat Rev Immunol,2002，2(12):933- 944.

[16] 趙 穎，趙 英，竇海川，等.旋毛蟲對噁唑酮誘導的實驗性小鼠腸炎模型的干預研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2016,36(1):34- 41.

Zhao Y ,Zhao Y ,Dou HC,etal.Effects of Trichinella spiralis infection on a murine model of OXZ- induced colitis[J].Chin J Microbiol Immunol,2016,36(1):34- 41.

[17] Tilg H,van Montfrans C,van den Ende A,etal.Treatment of Crohn′s disease with recombinant human interleukin 10 induces the proinflammatory cytokine interferon gamma [J].Gut,2002，50(2):191- 195.