牛磺酸鋅對慢性染汞大鼠皮層內膽囊收縮素陽性神經元的影響

王　衍　陳　玲　張海峰

(滄州醫學高等?？茖W校，河北　滄州　061000)

汞作用于中樞神經系統，會造成人或動物學習記憶能力的減退〔1〕。膽囊收縮素(CCK)是一種與學習記憶功能密切相關的神經肽，主要分布于皮質和海馬結構〔2〕。本研究探討牛磺酸鋅(TZC)對慢性染汞大鼠皮層CCK陽性神經元的影響。

1　材料與方法

1.1分組及實驗動物的準備天津市實驗動物中心提供的健康成年雄性大鼠32只。共分為4組各8只。對照組：飼單蒸水；染汞組：飼0.6 g/L氯化汞溶液后飼單蒸水；汞+低劑量TZC組：飼含0.6 g/L氯化汞溶液后飼0.23 g/L TZC溶液；汞+高劑量TZC組：飼0.6 g/L氯化汞溶液后飼0.46 g/L TZC溶液；汞攝入量均控制在4.3 mg·kg-1·d-1，飼料均為普通飼料。喂養1個月后進行實驗。

1.2迷宮實驗采用張家港市生物醫學儀器廠生產的MG3型三臂迷宮進行測試，迷宮的每個臂內，光、電刺激不同時出現，且保持三臂中兩臂有電刺激、一臂有光刺激。將大鼠放入光刺激臂內適應60 s，切換光刺激臂，待大鼠進入光刺激臂后計時，每隔30 s隨機切換光刺激臂，共切換20次/d。最后一次切換后，待大鼠進入光刺激臂并適應30 s后將大鼠取出。每只大鼠連續9次直接從電刺激臂進入光刺激臂為學會，直至所有大鼠學會實驗停止，記錄大鼠學會前訓練的次數，繪制散點圖。

1.3實驗試劑Vector公司生產1∶2 000 CCK抗體、上海溶劑廠生產的多聚甲醛、Vector公司生產1∶100的卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)液等。

1.4取材和切片用0.4%戊巴比妥鈉對實驗大鼠進行腹腔麻醉，顯露心臟，自心尖將灌注針插入左心室，開放右心耳以便灌注液排出，將生理鹽水100～150 ml自左心室快速注入，之后注入4%多聚甲醛(4℃)500 ml，30～40 min內完成，迅速取出實驗大鼠腦組織，用4%多聚甲醛(4℃)固定6～9 h，之后將腦組織依次置于10%，20%，30%的蔗糖溶液中各3～4 h。取右側腦皮層置恒冷箱冰凍切片機內切片(片厚約50 μm)，用pH7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)接片。

1.5免疫組化染色將切片置入Triton-H2O2(37℃)中持續30 min，以PBS漂洗，然后用3%正常羊血清封閉30 min后，加入CCK抗體，在4℃環境下孵育72 h。漂洗后加二抗孵育60 min，漂洗后用ABC液孵育60 min，漂洗后以0.05%的二氨基聯苯胺(DAB)、0.01%過氧化氫(H2O2)顯色、裱片、脫水、透明、封片。每組選取對應斷面的切片15張，分別計數染色陽性神經元。

1.6統計學處理采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析及LSD檢驗。

2　結　果

2.1迷宮實驗與對照組〔(63.38±13.70)次〕相比，染汞組〔(96.13±7.57)次〕、汞+低劑量TZC組〔(92.00±13.21)次〕、汞+高劑量TZC組〔(78.75±19.02)次〕學會之前的訓練次數明顯增高(P<0 05)；與染汞組比較，汞+高劑量TZC組在迷宮實驗中學會前的訓練次數明顯減少(P<0 05) 。

2.2免疫組化染色結果與對照組(99.80±9.15)相比，各組皮層CCK陽性神經元數均明顯減少(P<0.05)，汞+低劑量TZC組與汞+高劑量TZC組大鼠皮層膽囊收縮素陽性神經元數(80.07±5.50、89.33±7.12)較染汞組明顯增多(69.67±7.22，P<0.05)。汞+高劑量TZC組較汞+低劑量TZC組皮層CCK陽性神經元數明顯增多(P<0.05)。

3　討　論

CCK參與內臟調節和感覺傳導，具有較強的興奮作用，CCK在腦組織中主要以硫酸化八肽CCK形式存在。有實驗證實〔3〕，給實驗動物注射CCK后，可明顯提高實驗動物學習記憶能力，注射CCK抗血清后，實驗動物的學習記憶能力明顯下降。研究證實〔4〕，CCK增加實驗動物皮層細胞和海馬星形膠質細胞內鈣離子的濃度，由此推斷，CCK可能通過增高實驗動物細胞內鈣離子濃度，進而激活一氧化氮合酶，升高腦組織一氧化氮水平，最終達到促進學習記憶的效果。汞對中樞及周圍神經系統都會造成損傷，對中樞神經系統的損傷主要表現在精神行為控制能力下降、學習記憶能力下降等。其作用機制可概括為：①氧化應激作用；②導致星形膠質細胞數量變化；③影響神經細胞內鈣離子的平衡；④阻礙神經遞質的正常生理功能等。

?；撬峋哂卸喾N生理功能，在免疫系統、消化系統、生殖系統及神經系統維持生理功能方面發揮重要調節作用。鋅是人體必需的微量元素，含量及攝入量很少，主要分布在肝臟、肌肉和骨骼中，對機體的生殖發育、腦組織發育及認知能力的形成具有重要作用，而且體內多種酶類需要鋅的參與才能發揮作用，缺鋅會導致機體免疫力下降及神經組織損傷。TZC作為鋅與?；撬嵝纬傻慕j合物，可以有效防止鋅在通過消化道時形成不溶性的化合物或被不溶性的膠體吸附，還可以防止氧化及其他金屬元素對鋅的拮抗作用，TZC在消化道內可以以氨基酸的形式被吸收而不依賴于載體，具有更好的生物利用度，在對機體學習記憶能力的保護方面能起到更好的作用〔5〕。

本研究結果推斷可能是由于汞離子進入機體后，導致脂質過氧化，損傷DNA分子，大量消耗體內活性巰基，機體清除自由基的能力下降，造成對機體的損傷。谷胱甘肽抗氧化物酶系統在保護氧化損傷方面具有重要作用，汞離子進入機體后，大量消耗還原型谷胱甘肽，造成線粒體及細胞內大量活性氧聚積，導致細胞死亡信號傳導系統被激活，汞離子進入體內后，抑制谷胱甘肽過氧化物酶等抗過氧化物酶的活性，使機體清除自由基的能力下降，同時又產生大量自由基，進一步增強脂質過氧化反應。另外汞離子還可通過打破鈣離子的平衡，使細胞內鈣離子聚積，進而激活核酸內切酶、破壞DNA雙鏈結構，還可使細胞凋亡基因大量表達，從而導致細胞凋亡。

本實驗說明汞確實對實驗大鼠的學習記憶能力產生了明顯的抑制作用。本研究說明TZC對大鼠皮層膽囊收縮素神經元數有明顯的保護作用。生物體內，汞離子的作用是保護生物膜、保護細胞膜、清除自由基、防止自由基損傷等，汞離子相對于鋅離子具有更強的組織親和力，對鋅離子具有競爭性抑制作用，所以當汞離子進入體內后，體內鋅穩態被打破，造成體內鋅水平下降，導致需要鋅離子參與的某些生化反應的酶類活性降低，如超氧化物歧化酶等，實驗大鼠攝入汞離子后，這種競爭性抑制得到一定程度的緩解，而且鋅是超氧化物歧化酶的重要組成，后者參與機體的抗脂質氧化作用，此外鋅能夠使谷氨酸誘導細胞凋亡基因的作用得到抑制，從而降低汞對機體的損傷；?；撬嵩谥袠猩窠浵到y中含量較高，具有抗氧化、保護細胞膜等多種生理功能，研究顯示〔6〕，?；撬釋ι窠浖毎麅肉}離子濃度具有雙向調節作用，防止細胞內鈣超載，能明顯提高神經元的存活率，促進神經系統生長發育、增殖分化，增強大鼠學習記憶的作用。牛磺酸還有作為抗氧化劑和細胞調節因子參與保護神經元的作用〔7～9〕。 ?；撬釋毎さ谋Ｗo作用和對鈣離子穩態的調解作用還可以抑制汞離子對血腦屏障的破壞。

本實驗飼喂的鋅是與?；撬崤湮坏挠袡C鋅，更易于被吸收，推斷其機制可能為：①?；撬岣鸬搅诵》肿优潴w的作用，有效防止了絡合鋅的形成；②?；撬岣せ钕兰毎ど系匿\離子載體，加速鋅的吸收；③?；撬峒せ罴毎ど系拟c鉀泵，造成產能增加，鋅的吸收加快。因此當鋅與牛磺酸合用時能夠對實驗動物的神經細胞起到更好的保護作用。

本研究提示，TZC對大鼠皮層CCK神經元數的保護作用與TZC的劑量密切相關；但有研究顯示〔10，11〕：補鋅量低或高其保護作用都達不到最佳效果，有關?；撬徜\對神經系統發揮保護作用的最佳劑量確定還有待進一步研究。

1Dewied KG.Peptidexgic modulation of learning and memory processses〔J〕.Pharmacol Rev，2004；46：269-91.

2Wettstein JG，Bueno L，Junien JL.CCK antagonists：phannacology and therapeutic interest〔J〕.Phannac Ther，2005；62：267-82.

3Meziane H，Devigen C，Tramu G，etal.Effect of anti-CCK-8 antiserum on acquisition and retrieval by mice in an appetitive task〔J〕.Peptides，2001；14：67-73.

4Muller W，Heinemann U，Berlin K.Cholecystokinin activates CCKB receptor mediated Casignaling in hippocampal astrocy〔J〕.J Neurophysiol，2004；78：1997-2001.

5石磊，糜志遠，張迎慶，等.?；撬徜\的研究進展〔J〕.廣州化工，2012；40(7)：57-9.

6Chen XC，Pan ZL，Liu DS，etal.Effect of taurine on human fetal neuron cells：proliferation and differentiation〔J〕.Adv Exp Med Biol，1998；442：397-403.

7Rivas-Arancibia S，Willing AE，Zigova T，etal.The effects of taurine on hNT neurons transplanted in adult rat striatum〔J〕.Cell Transplant，2011；9：751-8.

8Hilgier W，Zielinska M，Boikowska HD，etal.Changes in the extracellular profiles of neuroactive Am ino acids in the rat striatum at the asymptomatic stage of hepatic failure〔J〕.J Neurosci Res，2003；56：76-84.

9Keys SA，Zmerman WF.Antioxidant activity of retinal，glutathione，and taurine in bovine photoreceptor cell membranes〔J〕.Exp Eye Res，2011；68：693-702.

10劉文波，高貝貝，楊春燕，等.?；撬徜\對鉛暴露大鼠脂質過氧化損傷的拮抗作用〔J〕.現代預防醫學，2015；42(6)：1002-8.

11Kan TY，Chio CC，Lm MT，etal.Hypothalamic dopamine release and local carebral blood flow during onset of heat-5 troke m rats〔J〕.Stroke，1994；25：2483-7.