河南油田污染土壤生物聯合修復技術研究

劉子菡 郝春雷

摘要：采用土著茵群、無機鹽、向日葵進行了石油烴降解試驗，結果表明：石油烴降解率達到了76.3%，土壤石油類含量由5621.6 mg/kg下降至1332.3 mg/kg，為石油烴污染土壤治理提供了生物聯合修復的實驗數據支撐，該技術是土壤環境治理技術的發展趨勢。

關鍵詞：油田;土壤污染;向日葵;石油烴降解菌;就地修復

中圖分類號：X53

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）4-0117-04

1 引言

河南油田地處河南省西南部的南陽盆地，土壤類型為黃棕壤，是黃紅壤與棕壤之間的過渡性土類，微酸性。河南油田產出原油為低硫石蠟基類稀油和瀝青基類稠油，東部11個油田生產的原油，除3個稠油油田外，近80%的原油具有含蠟高、含硫低、凝固點高、輕質餾分比例低等特點。隨著油田開采時間的延長，油水管線腐蝕穿孔、泄露造成的土壤污染，以及集油站、油水井井場等生產設備密集場所的土壤現狀不容樂觀，同時，關停井井場的土壤修復、復耕已迫在眉睫。如何高效地進行石油烴污染土壤的修復是擺在石油人面前的難題。

自然環境中的微生物極其豐富，當生存環境被污染后，微生物群落結構會發生變化，適應石油污染的種群繼續發展或更好地發展，不適應石油污染的種群就會受到抑制最終被淘汰。土壤中石油烴的降解是混合菌共同作用的結果，通常不同的降解菌降解不同類型的石油烴分子，原油降解是由多種石油烴降解菌協同完成的[1]。在實際環境中，微生物種類繁多，作用復雜，它們根據需要構成一個特殊的生態群體[2]。大量研究表明，當菌群處于石油污染環境中時，利用烴類化合物的微生物數量急劇增長，在這個生態群體中，有些菌株雖然不能單獨利用污染物，但是能利用中間代謝物生長，有的菌株拮抗其他菌株的降解，但是另一種菌株的存在又抵消了這種負作用，每一種菌在石油降解的過程中都有其用途[3]，因此，使用土著菌群而不是分離出單株菌株進行試驗是一種有益的嘗試。

在被污染的環境體系中，石油烴是微生物可以利用的大量碳底物，但它只能夠提供有機碳而不能夠提供其他營養物，因而氮、磷常常是限制微生物活性的重要因素[4]，為了使污染物完全降解，營養物是影響微生物降解的重要因素之一，有機和無機肥料的添加可在不同程度上提高石油烴的降解率;同時，土壤含氧量、含水率也對石油烴降解起到重要作用，地表植物的種植可以改善土壤含氧量與含水率狀態，有利于菌群更好地生存，同時植物對有機物也有吸收降解作用，有研究表明向日葵能減少土壤中多環芳香烴的能力。因此，烴降解菌群、碳源、營養鹽、含氧量、含水率、土壤有機質、植被等要素構成了一個系統，系統各要素之間協同作用，改善土壤污染狀況。

2 研究方法

本研究利用土著石油烴降解菌群、無機營養鹽、植物的共同作用進行石油烴污染土壤降解試驗。首先，使用采自不同采油井場的土壤，富集土著微生物菌群，在實驗室考察其在液態環境對石油烴的降解性能，選擇具有較好降解效果的土著菌群，進行復壯擴培，投加到河南油田污染土壤中;其次，通過種植向日葵，記錄其出芽率及植株生長情況以及烴降解率情況。

2.1 培養基的制備

（1）富集培養基：玉米漿干粉1.5 g，硝酸銨1.2 g，磷酸二氫鉀1.2 g，蒸餾水600 mL，pH值為7.21，培養基120℃滅菌20 min。

（2）細菌培養基：牛肉膏4g，蛋白胨10 g，氯化鈉5g，蒸餾水1000 mL，培養基120℃滅菌20 min。

（3）平板培養基：玉米漿干粉0.38 g，硝酸銨0.3 g，磷酸二氫鉀0.3 g，蒸餾水150 mL，瓊脂粉5g，pH值為7.23。培養基120℃滅菌20 min。

（4）石油烴降解菌培養基：玉米漿干粉1.5 g，磷酸二氫鉀1.2 g，硝酸銨1.2 g，蒸餾水600 mL，pH值為7.02，培養基120℃滅菌20 min。碳源為正十二烷2 mL。

（5）培養皿的準備：為微生物計數用，準備直徑90mm的培養皿數套。將培養皿清洗，在干熱滅菌箱中滅菌2h，滅菌溫度為250℃，冷卻后取出待用。

2.2 微生物的富集

將20 g石油烴污染土壤加入100 mL富集培養基中（每個樣品均做平行樣，3個樣品共6個培養基），置于250 mL錐形瓶中，使用脫脂棉將瓶口塞住，30℃、120 r/min搖床培養6d。待培養液渾濁，搖勻倒出80mL培養液，加入新鮮富集培養基80 mL，與上述培養條件相同轉接富集培養5d。

2.3 微生物的發酵

將細菌發酵培養基30 mL裝入100 mL錐形瓶中（每個富集培養基均做3個平行樣品，共18個培養基），使用透氣橡皮塞塞住瓶口，于120℃、20 min蒸汽滅菌，待壓力降至0時取出冷卻至45℃，在無菌試驗臺上將已渾濁的培養液分別在培養基液面上、中、下層吸取1 mL接轉至細菌發酵培養基中，30℃、120 r/min搖床培養24 h。

2.4 石油烴降解菌群的培養

待細菌發酵培養液渾濁后，在100 mL錐形瓶中加入富集培養基30 mL，在無菌試驗臺上將已渾濁的細菌發酵培養液接轉8 mL（菌液含量20%）至新培養基中，在每個錐形瓶中加入正十二烷2 mL（濃度5%），30℃、120 r/min搖床培養6d。

2.5 液態石油烴降解率與表面張力的測定

生物表面活性劑是微生物在一定條件下將某些物質轉化為具有表面活性的物質，它具有表面活性劑的性質，即具有親水、親油性，有降低表面張力的能力，同時具有較好的生物降解性[5]，因此測定溶液的表面張力，可以驗證石油烴降解菌的作用效果。表面張力測定使用ST-2000全自動界面張力儀，將培養液離心取上清液，將清液注入玻璃杯中，被測液體距杯口5～7 mm，按動升降按鈕，待鉑金環完全浸入液體后停止升降平臺上升，按動升降按鈕，隨著玻璃平臺下降，測定值不斷變大，液膜被拉破，玻璃平臺自動停止，自動顯示出該液體的實際表面張力。每組樣品的C號使用紅外光度法進行石油烴降解率的測定，以驗證石油烴降解菌在液態的降解效果。

2.6 菌落的計數

將表面張力最低的（石油烴降解效果最好的）3個取出，將滅菌的培養皿編號，從最大稀釋度的稀釋液中取1 mL稀釋液，加到相應編號的培養皿中，樣品加完后，將滅菌的培養基熔化并冷卻到45℃左右，分別倒入相應的稀釋平皿中，搖勻后，置于平臺上，待培養基凝固后，將平皿倒置于25～28℃恒溫箱中進行培養，培養24 h進行計數。

2.7 生物聯合修復試驗

取液態石油烴降解率最高的懸菌液，進行復壯，培養出的懸菌液在室外用花盆進行生物聯合降解實驗，供試植物選用向日葵，挑取一定量顆粒飽滿的種子，播種前浸泡2h，取井場含油土壤樣品混勻，分裝在12個花盆內，每個花盆分裝1000 mL，每組3個平行樣，編號A土壤為空白，不添加菌液與營養鹽，編號B為添加營養鹽（硝酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.2%）的含油土壤，編號C為添加菌液的含油土壤，編號D為添加菌液與營養鹽的含油土壤，每個花盆中播種3粒向日葵種子，每組共9粒，保持盆土濕潤，記錄每組土壤樣品的出芽時間、出芽率、植株高度、30 d石油烴降解率，生物聯合修復試驗具體流程見圖1。

3 實驗結果

微生物富集土壤樣品采樣地點選取魏崗油礦魏179井場、魏155井場、落地油污油池周邊三個區域的石油污染土壤，生物聯合修復實驗的土壤為三處的混合土壤。采樣點位選取在井口放空閥附近、原油最易污染的區域，距離地面5～10 cm處的土壤樣品，石油烴含量最低5326.3 mg/kg，高于《農用污泥中污染物控制標準》（GB 4284-84）中污泥類含油污染物控制標準3000mg/kg（0.3%），土壤樣品基本組成成分數據見表1。

3.1 表面張力

每組樣品測定A、B兩個石油烴降解菌培養液樣品的表面張力，具體數據見表2。

采自魏179井場的1#樣品表面張力值均低于采自魏155井場的2#樣品與采自污油池周邊的3#樣品，最低為1# -2B達到了28.49 mN/m。說明采集的污染土壤樣品中的菌種均能產生表面活性劑，且魏179井場的土壤表面張力最低，而生物表面活性劑同時具有較好的生物降解性，魏179井場土壤的菌群有較好的石油烴降解性能。

3.2 菌落計數

取每組樣品表面張力較低的1# -2B、2#-1A、3#-2B使用平板涂布法進行菌落計數，菌落計數情況見表3。

菌數最高的為污油池周邊污染土壤樣品3# -2B，其次為魏179井場土壤樣品1# -2B，說明污油池周邊及魏179井場污染土壤的菌種具有更好的繁殖能力，能被大量富集培養。

3.3 液態石油烴降解率

將液態石油烴培養基在搖床培養6d的懸菌液用四氯化碳為萃取液，使用紅外分光光度法測定石油烴含量，最后通過式（1）計算出各菌群的石油降解率，具體數據見圖2。

石油降解率（%）=初始石油濃度Co -測定石油逍度C×100%

（1）

初始石油濃度Co

由圖2可知，其中降解率最高的魏179井場土壤樣品1# -2C、1#-1C降解率達到了56.9%、51.9%，其次為污油池周邊土壤3# -2C降解率為47.1%，說明魏179井場富集培養的菌群具有較好的石油烴降解能力。

3.4 生物聯合修復實驗結果

取液態石油烴降解率最高的魏179井場土壤（1#-2）懸菌液，進行生物聯合修復實驗，花盆放置在室外露天處，使用晾曬自來水保持土壤濕潤，第3dA組出芽率33%，其余各組出芽率89%，第5dA組出芽率67%，B組89%，其余2組100%，第7dA組出芽率78%，B組89%，其余2組100%。見圖3。

30 d后將向日葵苗移出，每組3個盆土混合均勻，取適量樣品測定土壤石油類含量，其中D組樣品的土壤石油類含量降至1332.3 mg/kg，降解率達到76.3%，具體數據見表4。

由表4看出，A組未添加菌液與營養鹽，3d出芽率明顯滯后，出芽率僅33%，其余各組土壤出芽率達到了89%，而添加菌液的C、D組5 d出芽率就達到100%;說明向日葵種子的萌發明顯受到石油烴污染的抑制，經微生物降解后，含油土壤更適合向日葵的生長。30 d植株生長情況：A、B組最低的植株僅7 cm，3對葉片，而C、D組植株高度均勻，最低也達到15 cm，5對葉片，且A、B組由于出芽率較低，每盆植株平均2株，3株的就有1株特別矮小，而C、D組每盆3株長勢均勻，說明菌液的添加對向日葵的生長有明顯促進，對土壤毒性降低效果明顯。

30 d檢測各土壤的石油類含量，添加懸菌液與無機營養鹽的D樣品降解率最高，石油烴降解率達到了76.3%，土壤石油類含量由5621.6mg/kg下降至1332.3mg/kg，較單獨種植向日葵的A組土壤，降解率提高了59.1%;同時，未添加烴降解菌群的B組樣品石油烴降解率23.6%，而生物聯合修復的D組樣品，石油烴降解率提高到76.3%，提高了52.7%，說明石油烴降解菌在土壤修復中起到至關重要的作用;未添加無機營養鹽的C組樣品石油烴降解率57.5%，較添加營養鹽的D組樣品低了18.8%，說明添加適量的氮、磷營養鹽能使提高石油烴降解率。

4 結語

本研究將生物聯合修復石油烴污染土壤作為一個系統，針對河南油田原油、土壤的特性，在采油井生產場所取樣，富集、篩選高效土著石油烴降解菌群，與向日葵共同進行就地生物聯合修復試驗，30 d石油烴降解率達到了76.3%;生物聯合修復主要集中在亞表層土壤的生態優化，將土壤、植物、微生物組成的復合體系看成一個完整的系統來共同降解污染物起到了事半功倍的效果，植物通過光合作用為微生物提供氧氣，使土著微生物對污染物質進行最大程度的生物降解，微生物與植物共存，植物為微生物提供了生存場所，并可轉移氧氣使根區的好氧作用能夠正常進行;同時根系的分泌物、脫落物可為微生物提供大量營養，刺激根際各種菌群的生長繁殖，增強細菌的聯合降解作用;此外，植物根系可以伸展到不同層系的土壤中，故無需混合土壤即可使降解菌分散在土壤中;另一方面，微生物使污染物轉化成植物可以吸收利用的狀態，減輕了污染物對植物的毒性，提高了植物的耐受性，通過兩者的互利作用，彌補單一修復方式的不足，大大提高了石油烴降解效果，為黃棕壤石油烴污染治理提供了生物聯合就地修復的實驗數據支撐，該修復技術耗能低，環境友好，是目前生物土壤環境治理技術的發展趨勢。

致謝：本實驗得以順利完成要衷心感謝中國石油化工股份有限公司河南油田分公司工程技術研究院微生物研究所與河南油田勘探局環境監測站的技術人員，在儀器設備、技術指導、數據分析上提供了大力的支持，特此致謝。

參考文獻：

[1]金文標，宋莉暉，董曉利，等，油污土壤微生物治理的影響因素[J].環境保護，1998 （10）：27～28.

[2]張杰，劉永生，孟玲，等，多環芳烴降解菌篩選及其降解特性[J].應用生態學報.2003，14 （10）：17 83～1786.

[3]白潔，崔愛玲，呂艷華.石油降解菌對石油烴的降解能力及影響因素研究[J].海洋湖沼通報，2007（3）：41～48.

[4]金樑，顧宗濂.石油污染土壤及地下水的生物修復進展[J].應用與環境生物學報，1999（5）：130～135.

[5]李穎，賈麗娜，張鵬，高效生物修復菌株的篩選及其降解能力的研究[J].化工環保，2004，24（增刊）：15～17.