Notch信號通路調控Treg/Th17細胞機制的研究進展

張珊，劉寶山

Notch信號通路是一條高度保守的信號通路，在細胞間的信息交流中扮演重要角色。Notch信號廣泛存在于多種細胞中，如造血細胞［1］、巨噬細胞［2］等。在免疫系統中，Notch信號通路不僅可以調控T/B細胞譜系的產生，還參與調節外周成熟T細胞及其亞群分化及功能的發揮，如Notch信號可在CD4+T細胞表面廣泛表達，對調節性T細胞（Treg）、輔助性T細胞17（Th17）的增殖、分化、凋亡及細胞發揮免疫功能產生重要影響［3］。最近研究表明Notch信號通路與多種免疫功能異常的疾病有著密切的聯系，如再生障礙性貧血、類風濕性關節炎［4］、自身免疫性腦脊髓炎等。本文簡要綜述了Notch通路對Treg/Th17的調控機制及兩者在血液系統疾病、自身免疫系統疾病中的聯系。

1 Notch信號通路的組成與活化

Notch信號通路根據是否依賴RBP-Jκ可分為經典通路和非經典通路，其主要由Notch受體、配體、CSL DNA 結合蛋白（CBF1、Suppressor of Hairless、Lag1的合稱）、調節分子及其他效應物組成。目前發現哺乳動物中共有4種受體（Notch1-4）、5種配體（又稱為DSL結構域）。Notch配體分屬于2個家族：Dll家族（Dll1、Dll3、Dll4）和 Jagged家族（Jagged1、Jagged2）。由于Notch1-4的胞外端EGF區和胞內段的PEST區域存在較大差異，4種受體功能存在一定的差異，靶基因也有所不同。Notch1主要存在于胸腺細胞、巨噬細胞以及骨髓的前體細胞中；Notch2存在于胸腺細胞、B淋巴細胞以及前體細胞中；Notch3在許多不同種類的造血細胞中均有表達；Notch4主要存在于內皮細胞。對于Notch配體來講，Jagged家族、Dll家族在骨髓與胸腺中均有表達，對中樞免疫系統的淋巴細胞分化起著不同作用。Dll1、Dll4主要誘導造血干細胞、胸腺淋巴細胞向T細胞系列發育，但Dll1主要促進前體T細胞發育；Jagged1、2也可促進T細胞發育，但有向自然殺傷（natural killer，NK）細胞發育的潛質。

Notch受體以單體蛋白的形式合成，在S1位點被furin樣蛋白酶裂解，形成的2個亞單位以共價鍵連接，結合形成異二聚體。在受體轉移至細胞膜前，Fringe蛋白將EGF樣重復序列糖基化。當Notch受體胞外部分轉移至細胞膜與配體結合時啟動Notch信號途徑，隨后發生2次水解過程，釋放出具有核定位信號的胞質區（Notch intracellular domain，NICD），NICD轉移至細胞核內，與CSL（又稱為RBPJ或CBF1）結合并招募核轉錄激活蛋白MAML等，形成三元絡合轉錄激活物，激活下游靶基因如Hes、Hey、Deltex1、IL2RA等，進而調節細胞發育各個過程［5］。Notch蛋白還可以通過非依賴RBP-Jκ方式激活Notch通路，具體機制還不十分清楚［6］。此外，Notch信號通路還可與其他信號通路之間存在“對話”、“協同表達”，如核因子-κB（NF-κB）、缺氧誘導因子（HIF）、轉化生長因子（TGF）-β等。

2 Th17細胞及Treg細胞的生物學特性及功能

幼稚CD4+T細胞需要經過刺激從而分化成與細胞免疫密切相關的Th1、Th2、Th17、Treg等細胞亞群。其分化進程受到細胞外分子（如細胞因子）和細胞內分子（如轉錄因子）的調節。

Th17細胞因主要分泌白細胞介素17（IL-17）而得名，在自身免疫性疾病中發揮主要作用，其主要功能為招募中性粒細胞等炎性細胞，引起細胞浸潤、組織破壞。另外，Th17還可分泌IL-21、IL-22、IL-26等多種細胞因子。Th17細胞核內表達視黃酸相關孤 兒 受 體 γt（retinoid acid-related prphan receptor gamma t，RORγt）和信號傳導及轉錄激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），兩者對Th17細胞的發育和相關細胞因子的產生極其重要［7］。Th17細胞的分化還受多種細胞因子的調節，IL-6、TGF-β、IL-21、IL-23等在Th17細胞分化過程中起積極的促進作用，而IL-27、IL-2、干擾素（IFN）-γ等則參與Th17細胞分化發育的負向調控［8］。

Treg細胞由Gershon等發現，在維持體內免疫穩態過程中起關鍵作用［9］。初始T細胞可在TGF-β作用下生成Treg，而Treg細胞主要分泌IL-10、IL-35、TGF-β等細胞因子。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子（Fork/winged helix transcription factor，Foxp3）作為免疫調節的關鍵因子，是Treg細胞的特異性轉錄因子，影響Treg細胞的分化及功能。Treg細胞功能失調及Foxp3表達異常均可導致機體的多器官自身免疫反應及早期死亡［10］。

3 Notch信號通路對Treg/Th17細胞的調控

間充質干細胞（MSCs）介導的免疫調節參與Treg 細胞的增殖，而此過程依賴 Jagged1［11］。Yao等［12］在體外培育Treg細胞時，發現蛻膜血管內皮細胞（decidua vascular endothelial cell，DVEC）表面表達Notch配體如Jagged1、Dll1、Dll4，可維持Foxp3的表達，進而促進Treg細胞的增殖和分化，同時在Treg細胞表面可檢測到高表達的Notch1受體，使用慢病毒shRNA轉導下調Treg表面Notch1受體可使Foxp3表達下降，而Foxp3是Notch信號通路下游的靶基因。另外，Notch信號通路和TGF-β信號通路之間存在對話，TGF-β通路活化后可上調Hes1的表達［13］，Notch也可與 TGF-β通路內的細胞傳感器Smad3協同合作，或者NICD與Smad3直接作用，在CSL和NICD存在的情況下，Smad3被招募到CSL結合位點，從而對調控Treg的分化產生影響。

Keerthivasan 等［14］研 究 表 明 Notch1 可 通 過RORγt和IL-17基因啟動子調控Th17細胞的表達。Wang等［15］則認為Jagged1通過降低RORγt的表達，進而抑制Th17細胞的分化。也有研究認為RBPJ是IL23R關鍵驅動者，IL-23R信號也參與Th17細胞的調控，RBPJ通過綁定和反式激活IL23R啟動子誘導IL-23R表達［16］。另外，樹突細胞（dendritic cell，DC）表達的Notch信號可作為Treg/Th17平衡的調節器。有研究發現RBPJ缺陷小鼠的DC促進了Th17細胞的分化，而抑制Treg細胞的分化；這與其可表達少量的Aldh1a2蛋白有關，該蛋白能促進維甲酸的合成；但RBPJ缺陷小鼠的DC過表達Aldh1a2蛋白，卻不能促進Th17細胞的分化［17］。

3.1 Notch通路調控Treg/Th17與造血系統疾病的關系 再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種自身免疫性疾病，Li等［18］研究發現Notch/RBP-J/Foxp3/RORγt途徑可以調控Th17/Treg細胞的平衡，AA患者輸注MSCs后外周血中Th17比例下降、Treg比例增加，而且Dll1、Jagged1、Notch1-2也有所增加；該團隊進一步檢測了AA患者Notch相關轉錄因子的表達情況，發現RBP-J、Foxp3增多，而RORγt降低；與轉錄因子表達相一致，細胞因子TGF-β升高，而TNF-α降低。這表明MSCs調節Treg/Th17平衡依賴Notch信號途徑，RBP-J作為Notch信號通路的效應蛋白，與Foxp3、RORγt之間存在密切聯系。Th17/Treg平衡失調在免疫相關性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）中也扮演著重要角色，Yu等［19］研究發現應用γ分泌酶抑制劑DAPT對ITP患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）進行處理后，RORγt、IL-17 及 Notch1、Hes1、Hey1表達減少，而Treg及Foxp3沒有顯著變化，Notch信號表達參與了ITP患者Th17細胞的調節，DAPT抑制Th17細胞分化與RORγt、IL-17轉錄下調有關，因此，Notch信號失活可能成為ITP患者潛在的免疫調節策略。然而黃文燁等［20］認為ITP患者體內Treg數量降低，表達和分泌TGF-β較少，誘導靶細胞表面Notch1表達上調及激活Notch1-Hes功能減弱，對靶細胞免疫抑制作用減弱，從而引起自身反應性T細胞過度活化。在T淋巴細胞白血病中，Luo等［21］證明了Notch信號與Foxp3之間存在“crosstalk”，Notch1信號通路可能通過p-ERK1/2、STAT1、NF-κB等靶基因參與Treg細胞的分化。

3.2 Notch調控Treg/Th17與自身免疫系統疾病的關系 Li等［22］研究發現過敏性哮喘患者較正常對照組Notch1 mRNA水平顯著增高，Th17/Treg細胞比例上調。這表明Th17/Treg平衡失調在過敏性哮喘中可能因Notch1過表達引起的，Notch1與Th17發育分化密切相關。另一項研究則發現給予DAPT的哮喘小鼠組較模型組IL-17水平降低，而IL-10、TGF-β水平升高［23］。Zhang等［24］認為IL-17水平下調與阻斷Notch信號后NICD表達降低有關。Huang等［25］進一步探索發現，Dll4同時可誘導Treg及Th17細胞的分化，但對Foxp3的調控存在優勢；阻斷Dll4后過敏性哮喘反應加重，而阻斷Jagged1作用則相反。

Notch信號的表達可能促進自身免疫性腦脊髓炎 （experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）等疾病的發生及進展。Wongchana等［26］發現巨噬細胞表面Notch1基因敲除的EAE小鼠IL-6和CD80表達降低，而且分泌的IL-17也減少，認為Notch1/CSL/RBP-Jκ通路可能通過調節IL-6及共刺激分子CD80的表達從而參與Th17的促炎反應。Bassil等［27］研究則發現在EAE小鼠模型中，Dll4可抑制TGF-β以及Foxp3表達過程中的酪氨酸蛋白激酶JAK3以及STAT5磷酸化，而STAT5是Foxp3表達必不可少的轉錄因子。而對于RA來講，Th17是其發病的重要免疫細胞，Treg細胞則有利于RA的緩解。有研究表明，RA小鼠經DAPT處理后，Th17細胞及IL-17減少，并顯著地降低了關節炎癥狀和關節損傷的嚴重程度［28］。而且Notch3與Th17增殖與分化密切相關，應用Notch3單克隆抗體可減少Th17細胞及相關因子的表達，但對Treg細胞無明顯抑制作用［29］。

3.3 Notch調控Treg/Th17與其他疾病的關系 Qin等［30］研究發現慢性丙肝患者較正常對照組PBMC中Notch1、Notch2 mRNA顯著增多，應用DAPT后，Th17相關因子RORγt、IL-17、IL-22等水平下降，而Treg相關因子Foxp3、IL-10水平沒有顯著變化，但Treg細胞的抑制功能降低。這表明Notch信號通路調控Treg與Th17細胞數量的同時，還可以對兩者的功能產生影響。Treg細胞在母體預防胎兒免疫排斥中起重要作用，敲除DEVC表面Jagged1和Dll1配體，Treg細 胞 表 達 受 到 抑 制［12］。 Cao 等［31］研 究 發 現 因Notch1-4受體及Dll4水平顯著升高，妊高癥患者外周血Th17相關因子增多，Treg相關因子減少。以上諸多研究證明，Notch信號通過調控Treg/Th17廣泛參與免疫系統疾病的發生、發展，Notch信號通路的激活可能是調節兩者關系的關鍵，進而可激活其他通路共同參與Treg/Th17的調控。因此通過調控Notch信號通路中的各個相關靶點，促進兩者調控的平衡，有利于免疫系統失衡疾病的恢復。

4 Notch信號調節的復雜性

由于不同疾病產生的內在環境不同，Notch信號受體與配體結合激活下游靶基因類型不同，由此可激活其他信號通路，因而同一種受體或配體對Th17和Treg細胞的調控不同。Contaz等［32］發現，Notch信號作用的發揮具有環境依賴性。當Notch負調控Th17細胞的分化時，Notch能夠通過影響胞內細胞因子的轉運而促進Th17細胞因子的釋放，從而抵消原有的效應。也有研究認為，Notch既不單一啟動T細胞程序，也不受細胞因子的影響，而是同時調控Th細胞的基因序列［33］。即使在強極性的情況下，Notch也可直接調節CD4+T細胞的分化。而且，Th17和Treg細胞在分化上高度相關，兩者具有高度的可塑性。這更增加了探究Notch通路調控Th17、Treg細胞平衡機制的難度。

5 總結與展望

綜上所述，Notch信號途徑在CD4+T細胞及其亞群的增殖、分化及功能的調節中具有重要意義，目前對Notch信號的研究尚處于起步階段，Notch信號通路介導調節Th17/Treg細胞機制及對機體各種疾病的影響尚未完全清楚，進一步探明Notch信號途徑及對CD4+T細胞的調節過程，不僅有助于免疫學理論的發展，還在血液系統疾病、自身免疫性疾病中均有潛在的應用價值。

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