五氯柳胺的殘留與臨床應用研究進展

白玉彬，邵莉萍，董 朕，張繼瑜

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業部獸藥創制重點實驗室，蘭州 730050)

五氯柳胺(Oxyclozanide) 屬于水楊苯酰胺類藥物，別名氯羥柳胺、羥氯柳苯胺、羥氯扎胺等，是一種氧化磷酸化解偶聯劑，可降低寄生蟲體內三磷酸腺甙(ATP)的合成量，從而導致蟲體因能量代謝紊亂而最終死亡。五氯柳胺不僅對牛、羊肝片吸蟲有較好的驅蟲效果，而且對絳蟲、線蟲也有活性，是一種廣譜、低毒、低殘留的化學合成藥物。作為治療肝片吸蟲病的主要藥物之一，五氯柳胺在國外得到了廣泛的應用，但在我國還沒有相關產品上市。開展五氯柳胺的殘留檢測研究，對于五氯柳胺的新藥研發、應用以及食品安全控制具有重要的意義。

1　五氯柳胺的應用現狀

肝片吸蟲病是一種世界性的疾病，在尼日利亞、巴基斯坦、中國、美國、伊朗等國家均有報道[1]。在澳大利亞每年有大約四千萬的羊和六百萬的牛感染肝片吸蟲[2]，僅僅養牛產業每年肝片吸蟲病的防治費用就高達2500萬美元[3]。在孟加拉國，肝片吸蟲病作為最主要的寄生蟲病，黃牛的發病率為60%，水牛的發病率為99.99%，山羊為12.29%，綿羊為8.34%，每年給孟加拉國造成約5411萬孟加拉塔卡的損失。在埃及，糞便檢查估計肝片吸蟲病流行率為12.70%[4]。El-Shazly等報道肝片吸蟲對于牛、水牛、羊、山羊的感染率分別為12.31%、9.73%、17.84%、5.40%[5]。全世界每年因肝片吸蟲所導致的損失超過32億美元。除此之外，肝片吸蟲還被認為是新興的人類疾病。在2006年，世界衛生組織評估240萬人感染肝片吸蟲，1.8億人處于被感染的風險中[6]。肝片吸蟲病給畜牧業的發展以及人類健康帶來了嚴重的影響，五氯柳胺作為治療肝片吸蟲病的主要藥物之一，具有良好的效果。Rolfe和Boray報道，以18.7 mg/kg.bw劑量給藥，在治療牛成熟和未成熟吸蟲方面，有效率可達到99%～100%[7]。Walley報道，以10 mg/kg.bw劑量給藥，在治療羊成年吸蟲方面，有效率為71%～85%，以15 mg/kg.bw劑量給藥，有效率為91%～97%，以20 mg/kg.bw劑量給藥，有效率可達到95%；以10 mg/kg.bw劑量給藥，在治療牛成年吸蟲方面，有效率為80%，以15 mg/kg.bw劑量給藥，有效率可達到92%[8]。至今為止，國外已上市的產品有五氯柳胺片劑OKZAN-F、口服混懸劑ZANIL Fluke Drench (34 mg/mL Oral Suspension)以及復方制劑左旋咪唑和五氯柳胺復方片劑、五氯柳胺(3%W/V)、左旋咪唑(1.5%W/V)復方混懸劑等[9]。五氯柳胺毒性低、殘留少且未見產生耐藥性的報道，作為治療肝片吸蟲病的主要藥物之一，其具有良好的市場應用前景。

2　五氯柳胺的臨床藥效學

國內外對五氯柳胺防治牛、羊等動物寄生蟲病的研究試驗有廣泛的報道，研究證明五氯柳胺不僅對治療肝片吸蟲具有良好的療效，而且還可以用于治療蛔蟲和絳蟲感染。

蔡登棣報道，用五氯柳胺治療黃牛肝片吸蟲感染，以30 mg/kg.bw劑量給藥，一周后剖檢，膽管中發現蟲體崩解物，無成活蟲體。分別以12 mg/kg.bw和20 mg/kg.bw劑量治療綿羊肝片吸蟲感染，12 mg/kg.bw組膽管中發現死蟲體20條，活蟲6條，而20 mg/kg.bw組膽管中無成活成蟲，且發現有死亡的童蟲[10]?？梢?，五氯柳胺不僅對成蟲具有殺滅效果，同時對于童蟲也同樣有效。

Paraud等用五氯柳胺治療山羊杯殖多布尼吸蟲(Calicophoron daubney)感染，在感染后第10天，用22.5 mg/kg.bw劑量的五氯柳胺治療，蟲體減少率82%。在蠕蟲感染131 d之后，分別以15 mg/kg.bw和22.5 mg/kg.bw劑量的五氯柳胺進行治療，蠕蟲減少率分別達到95.6%和95.9%[11]。由此可見五氯柳胺對于治療山羊杯殖多布尼吸蟲感染是非常有效的。

Mooney等采用多種抗寄生蟲藥在治療肝片吸蟲感染羊的對比試驗中，在第0天，分別給以三氯苯達唑、氯氰碘柳胺、五氯柳胺和硝碘酚腈，在感染后7、14、21、56 d分別收集糞便樣品。在治療后第56天，由于耐藥性的產生，三氯苯達唑組糞便中蟲卵減少量明顯低于90%，而在治療后第14天，氯氰碘柳胺組、五氯柳胺組和硝碘酚腈組糞便中蟲卵數減少100%[12]。說明五氯柳胺對于治療肝片吸蟲具有良好的療效。

Athar等報道，使用五氯柳胺治療肝片吸蟲、大片吸蟲等寄生蟲感染，給藥14 d后，糞便中的寄生蟲數量明顯減少，水牛的治愈率達到96.66%，肉牛的治愈率達到95.64%，日產奶量分別增加0.89、0.71 L，脂肪率分別增加0.42%和0.37%[13]。從而可以推斷出單一劑量的五氯柳胺對治療牛肝片吸蟲病有效。

Arias等在治療牛自然感染杯殖達布尼吸蟲中，分別采用阿苯達唑、奈托比胺、氯氰碘柳胺、五氯柳胺四種藥物進行對比治療。用10 mg/kg.bw劑量的阿苯達唑或用20 mg/kg.bw劑量的奈托比胺治療之后，糞便中蟲卵數減少0～26%，且經過治療之后有11%～39%的牛精神表現沉郁。而以15 mg/kg.bw劑量五氯柳胺或者10 mg/kg.bw劑量的氯氰碘柳胺治療后，糞便中蟲卵數減少97%～99%[14]。

Rodrigo Sanabria等用五氯柳胺治療前后盤吸蟲自然感染綿羊，實驗組在第0天口服20 mg/kg.bw劑量的五氯柳胺，72 h時第二次給藥，對照組不給藥，在第0天、3天、5天采集糞便樣品。第5天時糞便中蟲卵減少率99.5%，同時用高效液相色譜法對血清及胃腸道中五氯柳胺濃度進行檢測，測得血清中五氯柳胺濃度最高為20.7±11.5 μg/mL，小腸液中濃度為6.00±4.50 μg/mL。在瘤胃和腹腔液中測得的五氯柳胺濃度非常低，分別為0.05、0.02 μg/mL[15]。研究表明口服五氯柳胺對成熟的前后盤吸蟲有很好的治療效果。

EMEA等報道，以15 mg/kg.bw劑量的五氯柳胺單次給藥時，對牛的中樞神經系統以及腸道結構有不良的影響，表現為精神沉郁、腹瀉和厭食，當劑量大于50 mg/kg時，出現動物死亡。而以20 mg/kg.bw劑量的五氯柳胺給藥時，綿羊未表現出明顯的不良反應[16]。在動物吸蟲病的藥物防治中，由于三氯苯達唑、阿苯達唑、氯氰碘柳胺和硝碘酚腈等化學治療藥長期使用，寄生蟲均產生了抗藥性[17-19]，至今為止，對于五氯柳胺的耐藥性國內外還未見報道。

3　五氯柳胺的殘留檢測研究進展

3.1最高殘留限量(MRL)歐洲藥品管理局、澳大利亞以及食品法典委員會均制訂了牛羊組織中五氯柳胺的最大殘留限量，限量值分別為肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、腎100 μg/kg。歐盟規定五氯柳胺在牛奶中的最高殘留限量為10 μg/kg。我國目前還未有相關的藥物上市，所以我國農業部對五氯柳胺的最高殘留限量未作出明確規定。

3.2休藥期關于五氯柳胺休藥期的相關報道相對較少，Ali and Bogan等研究表明，將五氯柳胺以15 mg/kg.bw劑量口服給藥，測得其在羊血漿中半衰期為6.4 d[20]。Fujinuma等報道了將五氯柳胺以10 mg/kg.bw劑量給奶牛口服給藥，測得其在血漿中的半衰期為7.4 d，檢測限為2 μg/kg；在奶中的 半衰期為30～47 h，檢測限為1 μg/kg[21]。歐盟規定，五氯柳胺在牛、羊肉和內臟中的休藥期均為 28 d。

3.3五氯柳胺的殘留檢測方法

3.3.1高效液相色譜法Kyul Jo和 Hee-Jung Cho等建立了牛肉及牛奶中五氯柳胺的殘留檢測的高效液相色譜法，以乙腈和0.1%磷酸(4∶6)為流動相，出峰時間為8.3 min，定量限9.7～9.8 μg/kg，回收率為(70.70±7.90)%～(110.79±14.95)%[22]。

王偉等采用高效液相測定牛羊奶中五氯柳胺、硝碘酚腈、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的殘留量，建立的標準曲線在5～500 μg/kg范圍內呈現良好的線性關系，相關系數>0.99，檢測限為3 μg/kg，定量限為5 μg/kg，五氯柳胺在1/2最高殘留限量(MRL)、1倍MRL、2倍MRL添加水平下的平均回收率和相對標準偏差分別是87.40%～94.74%和5.40%～12.21%[23]。

Rodrigo Sanabria等使用高效液相色譜法對血漿及胃腸組織中五氯柳胺的殘留量進行了檢測，以100%乙腈(40%，A液)和0.025 mol/L乙酸胺 (pH=8.5，60%，B液)作為流動相，使用紫外檢測器在254 nm下進行檢測，測得保留時間為4.7 min，定量限為0.1 μg/mL，在0.1～40 μg/mL范圍內，平均絕對回收率為75%～86%[15]。

3.3.2液相色譜-串聯質譜法Whelan等采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶及奶酪中五氯柳胺的殘留量，以0.01%的乙酸水∶乙腈(9∶1)(A液)和5 mmol/L甲酸銨甲醇溶液∶乙腈(75∶25)(B液)作為流動相進行梯度洗脫，測得五氯柳胺的保留時間為6.83 min，在給藥后第三次(即第2天)采樣時測得五氯柳胺最高殘留濃度范圍為8～24 μg/kg，在給藥后第13次(即第七天)采樣后，測得殘留量小于1 μg/kg，低于最高殘留限量[24]。

李帥鵬等采用高效液相色譜-串聯質譜法研究牛、羊組織中硝碘酚腈、五氯柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留檢測方法，在1～100 μg/kg 范圍內呈現良好的線性關系，相關系數大于0.99。在牛、羊組織中的檢測限為1 μg/kg，定量限為2.5 μg/kg。在LOQ、0.5倍最高殘留限量(MRL)、1倍MRL、2倍MRL添加水平下，平均回收率為71%～112%，日內相對標準偏差(RSD) 為1.1%～14.0%，日間RSD為6.4%～14.7%[25]。

已報道的五氯柳胺的殘留檢測研究表明，各種檢測方法均具有良好的線性關系，且回收率范圍均符合相關規定，可以滿足臨床對五氯柳胺殘留檢測的需要。王偉等[23]所采用的測定牛羊奶中五氯柳胺殘留的液相方法，其平均回收率為87.40%～94.74%，與Kyul Jo和Hee-Jung Cho等建立的牛肉及牛奶中五氯柳胺殘留檢測的高效液相色譜法的回收率(70.70±7.90)%～(110.79±14.95)%[22]、Rodrigo Sanabria等所采用的測定組織樣品中五氯柳胺殘留的液相方法的回收率75%～86%[15]、李帥鵬等采用高效液相色譜-串聯質譜法研究牛、羊組織中硝碘酚腈、五氯柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4種苯酚類和水楊酸苯胺類抗蠕蟲藥的多殘留檢測方法的回收率71%～112%[25]相比，其回收率更高，且方法穩定性更好；其檢測限為3 μg/kg，定量限為5 μg/kg，相比于其他方法較低。而Rodrigo Sanabria等所采用的測定組織樣品中五氯柳胺的殘留的液相方法，其定量限僅為0.1 μg/mL[15]，相比于其他方法更低。

4　展　望

五氯柳胺作為一種化學合成類抗寄生蟲藥物，具有高效、安全的特點，五氯柳胺不僅對于治療肝片吸蟲病具有良好的效果，而且對線蟲和絳蟲效果顯著。對于牛來說，以10 mg/kg.bw劑量給藥，對于治療牛的大部分肝片吸蟲以及絳蟲的有效率可達到90%以上，同時可以促進產奶率以及脂肪率的增加，因此，建議以10 mg/kg.bw劑量給藥較宜；對于羊來說，以20 mg/kg.bw劑量給藥，羊膽管中無成活肝片吸蟲成蟲，在治療五天之后其糞便中蟲卵減少率可達到99.5%，因此，建議以20 mg/kg.bw劑量給藥較宜。隨著一些抗寄生蟲藥物的長期大量使用，寄生蟲病得到了有效的控制，與此同時，耐藥性的產生，也成為臨床用藥的重要障礙，20世紀90年代便有關于三氯苯達唑、氯氰碘柳胺耐藥性的相關報道，而五氯柳胺至今未出現耐藥性的相關報道，并且憑借其顯著的療效在國外得以廣泛應用。五氯柳胺作為治療動物肝片吸蟲病的主要藥物，其在國外得到了廣泛的使用，已有片劑、口服混懸劑、復方片劑、復方混懸劑等多種產品上市，而在國內還沒有相關的產品上市。目前所報道的多種五氯柳胺殘留的檢測研究表明，各種檢測方法均具有良好的線性關系，回收率范圍均符合相關規定，其樣品處理方法完全可行，可以滿足五氯柳胺殘留檢測的需要。

隨著我國草食畜牧業的發展，牛羊飼養量的正在迅速增長，獸藥的使用給養殖業帶來高效益的同時，由于獸藥使用量的大幅度增加，導致動物性食品獸藥殘留超標，直接危害人體健康。目前，我國有50%以上的?；加懈纹x病，隨著三氯苯達唑、氯氰碘柳胺等藥物耐藥性的產生，臨床藥效不斷下降，五氯柳胺作為治療肝片吸蟲病最好的藥物之一，開發和研制一種或幾種五氯柳胺的制劑不僅可以有效防治肝片吸蟲病，給人類帶來巨大的經濟利益，而且可以促進我國畜牧業的良性發展，但藥物的使用必定會帶來藥物殘留問題，本文對五氯柳胺的臨床藥效學和殘留檢測方法進行了綜述，以期為五氯柳胺的臨床應用以及殘留檢測研究和監測提供指導。

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