RNAi技術在作物改良的應用與展望

王泳植 盧堯舜 王錦達

摘要：指出了傳統方式培育出的農作物已難以滿足現代市場的需求，很長一段時間內，研究人員都被改艮作物品質用時長、耗費高、程序繁雜等問題所困擾，RNAi（ RNA interference）技術的出現，讓這些問題的解決取得了飛速進展。RNAi能沉默特定基因的表達，且擁有極高的精度和準度，通過RNAi技術，特定基因的表達可被高度下調，且不會影響其他基因。通過操縱RNA干擾的途徑，產生小RNA分子來改良作物中的基因表達，可以產生新的品質性狀，且在抵御生物和非生物脅迫方面有較高潛力。營養成分的改良，形態學上的改變和次生代謝物合成的增加，是RNAi技術另一方面的優勢。綜述了RNAi技術在作物改良的各方面應用，探討了RNAi技術存在的問題，并對RNAi技術在作物改良方面的未來前景作了展望。

關鍵詞：RNAi;作物改良;株型;營養成分;脅迫抗性

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）14-0239-04

1 引言

人類賴以生存的資源很大一部分來源于植物及其加工后的產物，隨著世界人口的增加，對于植物的需求與日俱增。耕地和水源的減少、生物及非生物脅迫、氣候變化等是抑制植物健康生長、減少植物產量的主要限制因素，這將導致未來的糧食安全問題，人體營養不良甚至饑荒。為了克服這些問題，開展現代育種技術、分子遺傳學、DNA重組和生物技術的研究，以期獲得具有病害抗性、耐脅迫和高產等優點的作物品種，生物技術的應用，尤其是基因工程，為作物改良帶來了重要突破。然而，基因工程技術在現代農業中的應用，是否符合生物安全準則，以及向作物巾導入其他有機體的基因所帶來的影響引起了公眾的關注，因此，有必要發展一種更加安全、更能被公眾所接受的作物改良技術。基于這點，RNAi技術引起了研究人員的廣泛關注，相比于基因工程技術，這項技術具有穩定性高、特異性強、效率高等優點，在作物改良方面有巨大潛力。就RNAi技術在作物改良的應用進行討論，對這項技術的問題及其前景進行展望。

2 RNAi的作用機制

外源基因利用宿主細胞進行轉錄時產生雙鏈RNA（ dsRNA），dsRNA隨后被細胞內的核酸內切酶切割成小片段RNA（ siRNA）;在RNA解旋酶的作用下，siRNA被解鏈為正義鏈和反義鏈;反義siRNA結合某些酶形成RNA誘導的沉默復合物（RISC）;RISC結合mRNA的同源區并切割mRlxIA，宿主細胞隨即針對這些mRNA產生降解反應。

3 RNAi在作物改良中的應用

3.1植物株型的改變

株型的改變包括株高、分枝、莖長和花葉形態等，它們與重要的農藝性狀如產量、生理生化過程、倒伏以及對抗環境脅迫的能力有關。

Xu等在實驗過程中發現，不定根出苗和生長在OsPINl RNAi轉基因作物中受到嚴重抑制，通過轉基因方法，OsPINl基因在水稻內的過度表達或抑制會導致分蘗數和根冠比的改變，說明OsPINl基因在不定根出苗和分蘗中起重要作用。Qiao等通過RNAi抑制了水稻中OsGA20ox2基因（編碼植物巾調節赤霉素合成的酶GA 20-氧化酶）的表達，導致轉基因水稻中的一個表型表達低量的GA1，這種表型株高降低并形成一種半矮桿的表型，與野生型相比，莖稈更短，抗倒伏能力強，且生產率更高。Hu等的研究表明水稻組蛋白脫乙酰酶（ HDAC）基因的過度表達并不會產生有顯著特點的表型，然而，通過miRNA使HDA703表達下調，減少了水稻花梗的伸長，RNAi沉默HDA704后，導致了水稻株高和葉型的改變。

3.2營養成分改善

世界范圍內數以百萬計的人口被慢性饑餓所影響，在發展中國家營養不良是最主要的問題，其中微量元素的缺乏會導致嚴重疾病甚至死亡。一種可行的解決方案是改善主食的營養品質，然而這些食物如水稻、玉米、小麥和豆類雖然能提供足夠的卡路里和蛋白質，但并不是營養全面的作物，僅食用這類作物會導致維生素和礦物質的缺乏，例如主食米飯的人更易缺乏維生素A和鐵元素。利用生物技術進行營養成分改良的安全件值得懷疑，因此這種方法的使用受到限制。RNAi因其高安全性，可用于改善作物的營養成分。

Eck等通過RNAi技術沉默了馬鈴薯中β-胡蘿卜素羥化酶（BCH，能使β一胡蘿卜素轉變成玉米黃質）基因，從而增加了β-胡蘿卜素的含量。過度食用高淀粉含量食品會導致二型糖尿病，直鏈淀粉不易被消化，不會顯著增加餐后血糖，Regina等通過RNAi技術，生產了四種含有高直鏈淀粉含量的玉米品系。棉子酚對人類具有毒性，是降低棉籽價值的主要因素，Palle等利用RNAi技術沉默了陸地棉（Gossypium hirsutum）中δ-杜松烯合成慕因的表達，產生了超低含量棉子酚的棉籽。馬建等為改良大豆品質，采用RNAi技術沉默了籽粒中脂肪氧化酶基因的表達，脂肪氧化酶活性降低，使大豆油粉含量得到提高。

3.3 非生物脅迫耐受性

環境脅迫因子如干旱、鹽堿、水澇和氣溫大幅波動是影響農業生產力最主要的因素之一，對新基因的探尋，對其功能和脅迫應答反應的研究，能為培育耐高強度非生物脅迫作物提供基礎。RNAi因其優異特性，已在多種植物的耐受性研究中得到應用，而miRNA在植物應對非生物脅追時有重要作用。

Jian等從水稻品種Oryza sativa L.中鑒定出新的與脅迫應答有關的miRNIAs，這些miRNAs能在水稻應對嚴寒、脫水和鹽堿時參與到應答通路中。番茄紅素-β -環化酶（LCY-β）是一種通過番茄紅素的環化，參與α-和β一類胡蘿卜素合成的關鍵酶，IbLCY-β基因與LCY-β有80%的序列同源性，Kim等將IbLCY-β一RNAi載體導入番茄愈傷組織，發現與未導入該載體的愈傷組織相比，抗干旱和鹽堿的能力顯著提高。Song等研究轉錄因子OsNAC5在水稻對非生物脅迫應答反應中的作用時，觀察通過RNAi技術沉默OsNAC5后的品種，過量表達OsNAC5的品種，野生品種在嚴寒、干旱和鹽堿等脅迫下的反應，發現沉默Os-NAC5后的品種耐受性最差，過量表達OsNAC5的品種耐受性最強。

通過RNAi技術能確定參與脅迫應答的關鍵因子，更好的理解植物抗環境脅迫的原理，為培育高環境脅迫耐性作物提供基礎。

3.4生物脅迫抗性

植物長期受到生物環境因子包括病毒、細菌、真菌病原體、寄生性植物和食草昆蟲等的攻擊，嚴重限制了作物的生產力，對經濟和生態造成嚴重影響，增強植物的生物脅迫抗性具有重要意義。許多小RNA（ sRNAs）積累在植物組織中，盡管在大小，序列，基因組中的分布不盡相同，但大多數sRNAs都能通過RNA沉默來抑制基因的調控，RNAi技術能在植物生物抗性的提高方面做出巨大貢獻。

Schwind等研究出能通過生產小發卡RNA （hpRNA），從而對馬鈴薯紡錘類病毒（PSTVd）產生抗性的馬鈴薯品種。Fairbairn等在研究應對根結線蟲的策略時，通過使轉基因馬鈴薯表達針對根結線蟲體內的轉錄因子Mj Tisll的hpRNA，沉默了Mj Tisll的表達，為食草害蟲的治理開辟了新道路。Li等用能沉默褐飛虱和玉米螟體內目標基因的dsRNA浸泡水稻和玉米的根部，并給害蟲喂食浸泡根部后的植物，發現害蟲死亡率顯著上升，說明可利用根部浸泡dsRNA的方法抵御害蟲。

3.5次生代謝物的合成

植物次生代謝物質是一種能對人類健康產生影響的膳食成分，具有很高的經濟價值，通過RNAi技術淵控對次生代謝物產生具有重要作用的多個基因，是一種高效的方法。

青蒿素是一種從青蒿（Artemisia carvifolia）中提取出的高效抗瘧疾藥物，然而青蒿素在A.carvlfolia中的含量卻很低，鯊烯合酶（ SQS）是甾醇合成途徑中的關鍵酶，與青蒿素的合成為競爭關系，Zhang等通過hpRNA介導的RNAi技術成功抑制了sos基因的表達，從而增加了A. carvifolia中青蒿素的含量。馬鈴薯糖蛋白是一種蛋白酶抑制劑，屬于馬鈴薯塊莖蛋白的一種，馬鈴薯塊莖可作為人體治療性糖蛋白合成的生物反應器，Kim等利用RNAi技術減少了馬鈴薯糖蛋白的含量，將馬鈴薯塊莖改造成一種高效的蛋白質表達系統。芥子油苷是芥菜（Brassica juncea）中的一種抗營養成分，且會降低進餐適口性，一般含量為80～120μmol/g，BjMYB28是參與芥子油苷合成的基因，Augustine，等通過RNAi技術沉默了BjMYB28的表達，將B.juncea中芥子油苷的含量降至11. 26μmol/g。

3.6有害成分的移除

無論是人工培養的還是自然牛長的作物，都含有某些有害物質，而清除這些有害物質又是一項繁雜的工作，RNAi技術在移除植物有害成分方面有著廣泛地應用。

棉花是生產纖維和食用油的重要來源，而棉子酚是棉花中的毒性成分，Sunilkumar等通過sRNAs沉默了參與棉子酚合成的杜松烯合成基岡，降低了棉籽和棉籽油中棉子酚的含量。植物螯合肽（PCs）在重金屬合成中有重要作用，為了降低水稻的鎘含量，Li等用RNAi技術沉默了參與PCs合成的基因OsPCSl的表達，與普通水稻相比，RIxIAi水稻的鎘含量降低了半。煙草中的N-亞硝基降煙堿（NNN）有致癌作用，在煙草中通過尼古丁N-脫甲基酶（ NND）合成，Lewis等利用RNAi技術沉默了NND基因的表達，使RNAi煙草的NNN含量與普通煙草相比降低了6倍。

3.7 水果貯藏壽命的延長

水果是膳食營養中一種重要的補充成分，然而水果在收獲后處理的過程中會遭受巨量的損失，在世界范圍內可達到數十億美元，許多基因不僅參與到了水果成熟的過程中，還與水果的腐敗有關，延緩水果的后熟進程已經成為研究熱點。

果膠裂解酶（ PelC）能有效改善果肉硬度，Yang等鑒定了22種馬鈴薯中的PelC基因，發現SIPL在馬鈴薯成熟過程中顯著表達，利用RNAi技術沉默了SIPL，增強了馬鈴薯果肉硬度并延長了貯藏壽命。Elitzur等通過RNAi技術沉默了與香蕉成熟有關的MaMADSl和MaMADS2的表達，發現香蕉變色和變軟的過程延長，成功培育出成熟延緩、貯藏期延長的表型。

4結語

RNAi技術具有效率高，穩定性高，特異性強等優點，使其相比于傳統的基因工程技術，在作物改良方面具有更廣泛的應用。RNAi技術能對作物株型做出定向改變，使作物具有理想的農藝性狀;能增強作物非生物脅迫耐受性與生物脅迫抗性，提高生活力;能改善營養成分并移除有害成分，增加對人體的營養價值;能增加次生代謝物的合成，提高作物經濟價值;還能延長水果貯藏壽命，減少收獲后處理造成的經濟損失。

5展望

盡管RNAi技術在作物改良方面具有諸多優點，但該技術存在的問題還需進一步研究并解決，豐要存在的問題有：①有效siRNA的設計與合成;②有效干擾載體的構建;③某些RNA靶序列可能位于高度折疊的區域，或隱藏在二級結構下，不易接近siRNA，被識別并切割;④某些蛋白質會與RNA序列形成緊密復合物，阻礙siRNA識別這些序列;⑤某些基因與靶基因同源性較高，會被錯誤的沉默。

隨著研究人員對植物基因組不斷深入的研究和對RNAi技術的理解與逐步完善，再結合RNAi技術本身具有的高特異性、高穩定性及高安全性等優點，RNAi技術將會在植物特定基因的功能研究中占有越來越重要的地位.也會在作物改良方面有更加廣泛的應用，為研究人員帶來重要的科研價值并為改善國民生活作出巨大貢獻。