組蛋白甲基轉移酶EZH2抑制劑聯合抗癌藥物對膀胱癌細胞功能影響的研究

孟旭英，李珍瑾，郭劍超

（天津醫科大學第二醫院內分泌科,天津 300211）

膀胱癌是泌尿系統最嚴重腫瘤之一，排在十大常見腫瘤的第9位，幾乎可以發生在任何年齡，兒童中也時有發生[1]。年齡越大，膀胱癌的發病率也越高，以50～70歲為最高，其中男性發病率高于女性3～4倍，在三大泌尿系腫瘤疾病中，中國人群發病率最高[2]。隨著科技的發展，技術的提高，多數膀胱癌可以得到準確的診斷和有針對性的治療，然而，隨之而來，診斷和治療的局限性也日趨凸顯，需要新的理念以及治療方法來改善。EZH2屬于核心酶PRC2的一個亞基，通過對組蛋白H3的第27位賴氨酸進行三甲基化，從而促進轉錄沉默[3-6]。相關證據表明EZH2的甲基化功能不僅僅是主要的表觀遺

傳阻遏物，而且通過不同途徑激活基因表達在表觀遺傳學癌癥的治療中也具有臨床意義[7]，目前許多可以專門抑制EZH2酶活性的小分子抑制劑已經開發出來[8-9]。組蛋白甲基化修飾與腫瘤的發生發展密切相關[10]。本實驗采用MTT、劃痕實驗以及流式檢測細胞凋亡法研究組蛋白甲基化酶EZH2的特異性抑制劑與針對DNA的化療藥物絲裂霉素C(MMC)的單獨使用以及聯合使用對膀胱癌T24細胞株功能的影響，探討該抑制劑與藥物聯合使用以及應用于臨床的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細胞系購自美國ATCC細胞庫。鼠源β-actin單克隆抗體、兔源EZH2單克隆抗體、兔源H3單克隆抗體、兔源H3K27me3單克隆抗體（密理博有限公司）、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（美國Cell signing公司），胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司），SYBR?Green Master Mix（諾唯贊生物科技有限公司），高糖DMEM培養基（上海玉博生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司），ECL發光液（碧云天生物技術有限公司），EZH2特異性抑制劑UNC1999（美國Selleck Chemicals公司），絲裂霉素C（日本KyowaHakko公司）。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養與給藥方法 T24細胞無菌培養于含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基,37℃、5%CO2條件下培養以及傳代。給藥時保證UNC1999 的終濃度為 10 μmol/L，作用 48 h；MMC的終濃度 為 0．1 mg/L，作用 48 h。

1．2．2 實時熒光定量PCR法檢測EZH2的表達 分為（1） 對照組；（2）MMC 組；（3）UNC1999 組；（4）MMC+UNC1999組。各組分別用藥物處理，到達時間后收集細胞，Trizol法提取總的RNA，之后取出1 μg RNA逆轉錄，Q-PCR法擴增cDNA片段，序列如下：EZH2 上游 5′gttggcggaagcgtgtaaagactin 3′，下游5′gtatccttcgctgcttccattc3′；β -actin 上 游 5′TTGCTGACAGGATGCAGAAG 3′，下游 5′ATCCACATCTGCTGGAAGGT 3′。Q-PCR 反應體系：Mix 10 μL，primer F 0．4 μL，primer R 0．4 μL，Rox 0．4 μL，CDNA 2μL，ddH2O6．8μL。反應條件：94℃5min；94℃15s，60℃ 1 min，共循環 40次，95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

1．2．3 Western blot檢測 EZH2 以及 H3K27me3 蛋白的表達 各組細胞經不同的藥物處理方案處理，胰酶消化，收集細胞于1．5 mL離心管中，1 200 r/min離心5min，棄上清，加入1mLPBS清洗2次，1200r/min離心5 min，棄去上清，加入RIPA裂解液，漩渦震蕩,充分混勻，冰浴30min，4℃，12000r/min，離心15min，將上清轉移到1．5 mL離心管中，BCA法對蛋白質進行定量。加入6×Lodding buffer，混勻，100℃，煮沸5 min，保證蛋白質充分變性。配置聚丙烯酰胺凝膠，按定量的結果，取50 μg上樣量，80 V待Marker分開，接著120 V至溴酚藍到達凝膠底部，轉膜，300 mA 1．5 h，之后用含 5%脫脂牛奶的TBST封閉 2 h，兔單抗 EZH2（1∶2 000），H3K27me3（1∶1 000），H3（1∶3 000），鼠單抗 β-actin（1∶1 000），4℃過夜，之后用TBST于搖床上洗3次，每次5 min，羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶3 000） 室溫孵育 1．5 h，用TBST洗3次，每次5 min，ECl化學發光液顯色，Tanon 4500全自動化學發光圖像分析儀掃描。

1．2．4 MTT法檢測細胞的增殖能力 正常培養的T24細胞，待細胞密度匯集到80%以上對細胞進行傳代，調整濃度為5×104/mL，接種于96孔培養板,每孔150 μL，待細胞貼壁良好后,開始稀釋藥品，按照之前的分組與給藥方式處理細胞。另外正常組加入等量的不含藥物的培養基作為陰性對照,不加細胞的培養液作空白對照。各組均設6個復孔。MTT法測定藥物的細胞毒作用,藥物作用完成后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，再培養3 h，期間觀察，之后小心用移液槍吸棄培養液，于每孔加150 μL的DMSO，酶標儀選擇490 nm波長測定吸光度,用空白對照調零。計算細胞抑制率（%）。

1．2．5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 處于對數生長期的細胞，相同的濃度接種于6孔板中，按照方案用藥物處理，待作用時間到達后方可棄去培養基，用PBS洗3次，棄去，加入相同的無藥物的培養，接著用10 μL槍頭在6孔板孔中部劃線，待48 h后進行拍攝，比較各組細胞的遷移情況。

1．2．6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數生長期的細胞，按照分組接種于6孔板中，分別用藥物處理，到達時間后收集細胞，PBS洗滌2次，取3×105個細胞，加入195 μL結合液重懸細胞，之后加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻，常溫避光孵育10 min，離心，棄上清。加入200 μL結合液輕輕重懸細胞，加入20 μL PI混勻，將樣品用錫紙包裹，1 h內上流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2．1 Q-PCR法檢測EZH2基因的表達量 結果見圖1。UNC1999組、絲裂霉素C組與對照組相比EZH2表達水平明顯下調，而UNC1999和MMC組為最低，結果具有統計學意義（P＜0．001、P＜0．01），說明MMC以及UNC1999均引起EZH2表達水平的下調。

圖1 各組EZH2基因表達比例柱形圖Fig 1 Comparison of the expression levels of EZH2 gene in each treatment group

2．2 Western法檢測EZH2以及下游H3K27me3蛋白的表達水平 結果見圖2。UNC1999以及絲裂霉素C單獨作用于T24細胞均引起EZH2蛋白水平的降低，而兩者聯合作用為最低，同時下游H3K27me3表達水平與EZH2改變相同。

圖2 各處理組EZH2蛋白表達水平(A)以及H3K27me3蛋白表達水平(B)Fig 2 EZH2 protein expression level(A)and H3K27me3 protein expression level(B)

2．3 MTT法檢測4組T24細胞的增殖能力 圖3示，UNC1999抑制劑組以及絲裂霉素C組與對照組相比，T24細胞的增殖能力均降低，而兩者聯合作用為最低，此結果具有統計學意義（P＜0．001，P＜0．01）。

圖3 各處理組T24細胞增殖比例柱形圖Fig 3 ProliferationratioofT24cellsineachtreatmentgroup

2．4 劃痕實驗檢測4組T24細胞的遷移 圖4示，UNC1999以及絲裂霉素C單獨作用于T24細胞均引起T24細胞遷移能力的下降，而兩者聯合作用為最低，此結果具有統計學意義。

圖4 藥物處理后4組細胞的遷移情況Fig 4 Migration of four groups after drug treatments

2．5 流式細胞儀檢測細胞的凋亡 圖 5示，UNC1999以及絲裂霉素C單獨作用于T24細胞均引起T24細胞的凋亡水平上調，而兩者聯合作用為最大。

圖5 藥物處理后4組細胞的凋亡水平Fig 5 Apoptosis of four groups after drug treatments

3 討論

人類癌癥基因組測序顯示編碼染色質的各種組蛋白修飾基因的變異與癌癥[11-13]的發生發展密切相關。近些年發現的證據表明組蛋白甲基化修飾基因EZH2與許多癌癥存在密切關系[14-18]。EZH2是主要的組蛋白甲基轉移酶，能對組蛋白第27位賴氨酸進行三甲基化，對相關基因進行調控，參與多種癌癥的發生發展，其中包括前列腺，肺和膀胱癌。它不僅與癌細胞增殖相關，同時與癌細胞干細胞以及轉移也密切相關。另外，EZH2也參與了前列腺癌和乳腺癌的發展，可以作為侵略性癌癥類型的標志物預測臨床結果[19]。EZH2轉基因小鼠通過促進乳腺腫瘤病毒引起腫瘤的發生[20]。除此之外，胰腺以及乳腺癌干細胞的維持也需要EZH2表達[21]。因此，EZH2是一種有希望的癌癥治療靶點。

MMC屬于針對膀胱癌的主要的化療藥物之一[22]，屬于細胞周期的非特異性藥物,主要作用部位位于細胞核,通過破壞DNA的結構與功能來抑制或殺滅癌細胞。從理論上來說，單一用藥對于清除由異源細胞群體發育而來的腫瘤塊難度很大[23]，而且單一用藥會引起藥物毒性,特別在大劑量的應用時負面情況更加明顯。

當前，對于膀胱癌的治療主要采用單一的化療藥物處理，治療難度大，后期容易引起毒性，目前研究組蛋白甲基化修飾與相應的癌癥的發生發展是研究的熱點，但是關于組蛋白甲基化修飾基因抑制劑與膀胱癌化療藥物聯合使用的相關研究比較少，在這項研究中，我們通過采用EZH2的特異性抑制劑UNC1999以及化療藥物MMC處理T24膀胱癌細胞，探討單獨用藥以及聯合用藥對細胞的增殖遷移以及凋亡能力的影響，不單從基因角度闡明甲基化修飾對于膀胱癌細胞的發生發展的重要性，也將特異性的組蛋白甲基化修飾基因EZH2的小分子抑制劑與抗癌藥物的使用聯合起來，評估二者聯合使用以及單獨使用的效果，為后面針對膀胱癌治療的用藥方案提供參考。

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