胰腺導管腺癌中腺苷酸激酶4的表達及臨床意義

李辰運，孫彤，卓娜，田晶

（天津醫科大學第二醫院超聲科，天津300211）

胰腺癌是消化道惡性腫瘤中惡性程度最高、預后最差的惡性腫瘤之一，已經取代肝癌成為新的癌中之王。胰腺癌起病隱匿，發展較快，易發生轉移，手術切除率低，預后極差，5年生存率不足5%[1-4]。而突破診治胰腺癌的關鍵在于：立足基礎研究，深入理解胰腺癌發生發展的機制，從而尋找有效的診治手段。胰腺癌的發生、發展是一個極其復雜的過程，是多種因素共同作用的結果。85%以上的胰腺癌來源于胰腺導管上皮細胞，因此研究導管腺癌對胰腺癌的診療意義較大。胰腺癌的發病率近年來呈上升趨勢，2017年美國將會有53 670例新發病患，死亡人數將達到43 090人[1]。作為唯一可治愈胰腺癌的方法，根治性手術切除的機會在胰腺癌病患中的比例很低[2]。嗜神經浸潤是胰腺癌生物學特性之一，與其不良預后有關[3]。本研究通過回顧性分析接受胰腺癌根治手術治療的76例胰腺導管腺癌患者的臨床病理特點與隨訪資料，以免疫組織化學的方法檢測胰腺導管腺癌組織中腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4,AK4）蛋白的表達，探討AK4蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達及臨床意義，進而為胰腺癌患者的靶向治療提供理論依據。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 收集2012年1月-2016年7月期間天津醫科大學第二醫院76例胰腺導管腺癌患者手術切除的組織標本，分析其臨床病理資料。患者均行根治性手術切除治療，全部病例均經病理證實，術前未行化療或放療，具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、手術方式、CA19-9、黃疸等。76例病例中男性45例，女性31例；年齡43～62歲，中位年齡（53．6±5．75）歲；腫瘤：≤2 cm 者 13 例，＞2 cm 者63例；組織學分化程度：中高分化腺癌34例，中低分化腺癌42例；腫瘤分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期55例，Ⅲ期18例，本組入選無Ⅳ期病例；淋巴結轉移：陰性者57例，陽性者19例；神經受侵34例；脈管內瘤栓者23例。

比較分析不同組患者的臨床病理學特征，包括：分化程度、淋巴結轉移、血管受侵、脈管內瘤栓、神經受侵、腫瘤分期。腫瘤分期根據2010年第7版UICC和AJCC胰腺癌分期進行TNM分期。隨訪：以電話和查閱病歷的方式隨訪。隨訪起始時間為手術時間，隨訪截止時間為2017年6月或患者死亡時間。統計學比較兩組患者一般臨床資料和臨床病理學資料及分析預后影響因素。

1．2 試劑 AK4為兔抗人單克隆抗體，購自武漢愛博泰克生物科技有限公司（Catalog No:A2050），稀釋濃度為1∶200，免疫組化二步法檢測試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司（pv6002，通用型二抗）。

1．3 方法 胰腺導管腺癌組織進行福爾馬林固定，石蠟包埋，標本進行5 μm切片，行AK4免疫組化染色。免疫組織化學采用SP二步法，DAB顯色。染色切片于顯微鏡高倍鏡下 (400倍)隨機計數5個視野，計數100個腫瘤細胞，根據腫瘤細胞陽性染色百分率和染色強度綜合評價免疫組化結果。1．4 免疫組化染色結果的判定 AK4蛋白表達主要定位于腫瘤細胞的胞漿,也有不同程度的胞核著色，呈棕黃色顆粒狀。結果判定：陽性細胞方面：陽性腫瘤細胞數＜10%記0分；腫瘤細胞陽性百分率為10%～30%記1分；腫瘤細胞陽性百分率為30%～70%記2分；腫瘤細胞陽性百分率＞70%記3分。同時對陽性著色的腫瘤細胞的膜、漿染色強度進行評價：陰性記0分，弱陽性記1分，中度陽性記2分，強陽性記3分；計分范圍為0～9分。實際結果根據陽性細胞百分率分值和染色強度分值之積的分值判斷高表達（4～9分）或低表達（0～3分）。每個病例觀察5個高倍視野，在不知病理分級與臨床資料的情況下由兩位經驗豐富的病理科醫師讀片，釆用雙盲法判斷結果。

1．5 統計學方法 采用SPSS18．0軟件。兩組計數資料采用χ2檢驗。生存率的計算采用Kaplan-meier法，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗。檢驗水準以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 AK4在胰腺導管腺癌組織中的表達 76例原發性胰腺導管腺癌組織中有60例（78．9%）AK4蛋白高表達，76例癌旁組織（距離腫瘤組織3～5 mm處的胰腺正常組織）中僅29例（38．2%）AK4呈高表達，免疫組織化學的染色結果分別見圖1和圖2。胰腺導管腺癌與癌旁組織陽性率比較（χ2=26．051 7 2，P＜0．001），其表達差異有統計學意義。

圖1 AK4在胰腺導管腺癌組織中的表達Fig 1 Expression of AK4 in pancreatic ductal carcinoma tissues

圖2 AK4在胰腺導管腺癌癌旁組織中的表達Fig 2 Expression of AK4 in pancreatic tissues adjacent to ductal carcinoma

2．2 胰腺導管腺癌組織AK4的表達與臨床病理特征和預后的相關性 如表1所示，AK4的異常表達與胰腺導管腺癌分期、淋巴結轉移、神經受侵、脈管內瘤栓相關（P＜0．05），與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤大小無關。圖3示患者預后生存分析結果，AK4 均與患者預后明顯相關（P＜0．05）：AK4 高表達的胰腺導管腺癌患者術后中位生存期明顯短于AK4低表達的胰腺導管腺癌患者[（12．20±0．870）個月 vs(18．30±4．168）個月]。

表1 76例胰腺導管腺癌AK4表達與臨床病理特征的關系Tab 1 The relationships between AK4 expression and clinicopathologic features in pancreatic ductal carcinoma

圖3 AK4與胰腺導管腺癌患者術后預后相關性分析Fig 3 Analysis of correlation between AK4 expression and postoperativeprognosisofpatientswithpancreatic ductal carcinoma

3 討論

腺苷酸激酶是多種生物活細胞中高能量磷酸化轉移反應中的一種關鍵調節酶，在腺嘌呤核苷酸代謝和體內穩態中發揮重要作用，通過催化互變現象反應:ATP+AMP?2 ADP。目前，研究報道的AK共有9種，為AK1-9，進一步發現AK5、AK7、AK8和AK9定位在細胞質中，而AK6和AK9定位表達在細胞核中，AK2定位在線粒體中膜間空間，而線粒體基質中則存在著AK3和AK4。AK1的缺乏會導致血液病[5]，AK2對D黑色素的生長至關重要，而遺傳的AK2缺乏會導致網狀的發育障礙和神經性耳聾[6-7]。到目前為止，多項研究已報道了AK的結構和功能，并報告說它們在細胞能量代謝中起著重要作用[8-12]。而其中的AK4在線粒體基質中被定位并被認為是參與滲透壓、耐藥、惡性腫瘤轉化和ATP調節的一種關鍵酶。早期有文獻報道了鐵的螯合劑去鐵胺用于治療肝細胞癌，發現去鐵胺能提高AK4的表達水平，但具體機制不明確[13]。既往文獻報道已經克隆了編碼人類和小鼠AK4基因cDNAs[12，14]，并且AK4的表達式模式已廣泛應用于小鼠組織中[9]，但是，即使在線粒體基質中檢測到了AK4，AK4卻沒有顯示任何酶活性。隨后有文獻報道，未激活的AK4與線粒體內膜蛋白ANT相互作用[15]。與此相反，另一項研究證實AK4的激活是需要應用AMP:GTP和AMP:ATP作為其底物的[16]。因此，AK4是否顯示了經典的酶活性目前還是存在爭議的。另一項功能研究表明，AK4可能參與氧化應激反應，顯示它是由4種不同類型的藥物，包括四氯化碳等肝毒性的藥物所控制的一種蛋白質[17-18]。有趣的是，一項單中心研究發現，AK4能促進肺癌的惡性進展[19]。此外，據報道，在腎胚細胞HEK293和肝細胞中AK4是一個有價值的標記物[20]。最近，Lanning等[21]發現AK4是細胞內ATP水平的關鍵調節器，通過篩選RNA干擾（RNAi）庫，目標是超過1 000個核dna編碼的基因，這些基因的蛋白質產物局限于線粒體。

然而，AK4功能的分子基礎仍有待確定。2016年的一篇較為權威的文獻利用AK4小干擾RNA（siRNA），在HeLa細胞中結合核糖核酸（shRNA）質粒，進而降低AK4表達水平，發現AK4降表達后能提高ATP產量、抑制腫瘤細胞增殖、提高抗癌藥物的敏感性等，并進一步在體內實驗中證實了這些結論；同時，在代謝組學分析方面，證實AK4降表達后增加了諸如富馬酸酯和蘋果酸鹽等在內的三羧酸循環中間產物，而AK4過度表達則能降低它們的表達水平；電子顯微鏡檢測到AK4降表達的細胞中線粒體數目的增加；在基因組學研究中，利用微陣列分析檢測TCA循環中兩種關鍵酶的基因表達，發現琥珀酸脫氫酶A（SDHA）和oxoglutarate脫氫酶L（OGDHL）的水平增加[22]。這些發現為針對AK4進行有效的抗癌療法奠定了分子生物學的理論基礎。

目前，經過文獻檢索，關于AK4的相關報道國內僅有兩篇文獻，均證實AK4是一種細胞壓力反應蛋白，均能對細胞進行低氧應激保護，還都發現AK4表達升高能促進細胞生長及發育[23-24]。在機制上進行分析研究發現，利用AK4-FLAG的相互結合和相互作用，通過對這種復合物的免疫共沉淀及質譜分析，明確了線粒體內膜蛋白ANT與AK4的互相影響，而后又進一步通過反向的免疫共沉淀實驗得出了可靠的結論，即證實了AK4與ANT的相互作用和機制[23-24]。

本項研究表明AK4在胰腺導管腺癌中的異常表達與胰腺癌分期、淋巴結轉移、神經受侵和脈管內瘤栓相關，并且其表達與患者預后明顯相關。這可能揭示在胰腺導管腺癌組織中AK4通過相應機制參與胰腺導管腺癌的發生發展，產生了一系列的生物學效應，可能與淋巴結轉移、神經受侵、脈管內瘤栓等密切相關，促進胰腺導管腺癌的侵襲轉移，進而導致患者預后不良。

胰腺導管腺癌早期癥狀不典型、不特異[13]，其惡性程度很高，與其具有嗜神經生長的生物學特性有關。結合我們的結果可以表明，在胰腺導管腺癌組織中AK4基因的激活，可能通過一定的調控機制而促進胰腺癌的神經浸潤。由此可見，胰腺導管腺癌中AK4是一個重要的調節因素，隨著對其作用機制的深入研究，可能會成為胰腺導管腺癌治療的一個新靶點。

[1] Siegel R L,Miller K D,Jemal A．Cancer statistics,2017[J]．CA Cancer J Clin,2017,67(1):7

[2] Sun Q M,Zhou H,Binmadi N O,et al．Hypoxia-inducible Factor-1-mediated Regulation of Semaphorin 4D Affects Tumor Growth and Vascularity[J]．J Biol Chem,2009,284(46):32066

[3] Kang F W,Yin G,Lin Q,et al．Hypoxia-inducible factor-1α overexpression indicates poor clinical outcomes in tongue squamous cell carcinoma[J]．Exp Ther Med,2013,5(1):112

[4] Xu L F,Ni J Y,Sun H L,et al．Effects of hypoxia-inducible factor-1α silencing on the proliferation of CBRH-7919 hepatoma cells[J]．World J Gastroenterol,2013,19(11):1749

[5] Qualtieri A,Pedace V,Bisconte M G,et al．Severe erythrocyte adenylate kinase deficiency due to homozygous a–＞G substitution at codon 164 of human AK1 gene associated with chronic haemolytic anaemia[J]．Br J Haematol,1997,99(4):770

[6] Lagresle-Peyrou C,Six E M,Picard C,et al．Human adenylate kinase 2 deficiency causes a profound hematopoietic defect associated with sensorineural deafness[J]．Nat Genet,2009,41(1):106

[7] Pannicke U,Hoenig M,Hess I,et al．Reticular dysgenesis(aleukocytosis)is caused by mutations in the gene encoding mitochondrial adenylate kinase 2[J]．Nat Genet,2009,41(1):101

[8] Fujisawa K,Murakami R,Horiguchi T,et al．Adenylate kinase isozyme 2 is essential for growth and development of Drosophila melanogaster[J]．Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2009,153(1):29

[9] Miyoshi K,Akazawa Y,Horiguchi T,et al．Localization of adenylate kinase4inmousetissues[J]．ActaHistochemCytochem,2009,42(2):55[10]Noma T．Dynamics of nucleotide metabolism as a supporter of life phenomena[J]．J Med Invest,2005,52(3/4):127

[11]Tanimura A,Horiguchi T,Miyoshi K,et al．Differential expression of adenine nucleotide converting enzymes in mitochondrial intermembrane space:a potential role of adenylate kinase isozyme 2 in neutrophil differentiation[J]．PLoS One,2014,9(2):e89916

[12]Yoneda T,Sato M,Maeda M,et al．Identification of a novel adenylate kinase system in the brain:cloning of the fourth adenylate kinase[J]．Brain Res Mol Brain Res,1998,62(2):187

[13]Yamasaki T,Terai S,Sakaida I．Deferoxamine for advanced hepatocellular carcinoma[J]．N Engl J Med,2011,365(6):576

[14]Xu G P,Stevens J,White R．characterization of human adenylate kinase 3(AK3)cDNA and mapping of the AK3 pseudogene to an intron of the NF1 gene[J]．Genomics,1992,13(3):537

[15]Liu R J,Stroem A L,Zhai J J,et al．Enzymatically inactive adenylate kinase 4 interacts with mitochondrial ADP/ATP translocase[J]．Int J Biochem Cell Biol,2009,41(6):1371

[16]Panayiotou C,Solaroli N,Johansson M,et al．Evidence of an intact Nterminal translocation sequence of human mitochondrial adenylate kinase 4[J]．Int J Biochem Cell Biol,2010,42(1):62

[17]Yamamoto T,Kikkawa R,Yamada H,et al．Investigation of proteomic biomarkers in in vivo hepatotoxicity study of rat liver:toxicity differentiation in hepatotoxicants[J]．J Toxicol Sci,2006,31(1):49

[18]Fustin J M,Doi M,Yamada H,et al．Rhythmic nucleotide synthesis in the liver:temporal segregation of metabolites[J]．Cell Rep,2012,1(4):341

[19]Jan Y H,Tsai H Y,Yang C J,et al．Adenylate kinase-4 is a marker of poor clinical outcomes that promotes metastasis of lung cancer by downregulating the transcription factor ATF3[J]．Cancer Res,2012,72(19):5119

[20]Kong F Z,Binas B,Moon J H,et al．Differential expression of adenylate kinase 4 in the context of disparate stress response strategies of HEK293 and HepG2 cells[J]．Arch Biochem Biophys,2013,533(1/2):11

[21]Lanning N J,Looyenga B D,Kauffman A L,et al．A mitochondrial RNAi screen defines cellular bioenergetic determinants and identifies an adenylate kinase as a key regulator of ATP levels[J]．Cell Rep,2014,7(3):907

[22]Fujisawa K,Terai S,Takami T,et al．Modulation of anti-cancer drug sensitivity through the regulation of mitochondrial activity by adenylate kinase 4[J]．J Exp Clin Cancer Res,2016,35:48

[23]劉如娟．人源腺苷酸激酶4結構和功能的研究[D]．合肥:中國科學技術大學,2008

[24]孔凡志，楊煥民．腺苷酸激酶4對細胞低氧應激保護與增殖的調控研究[J]．畜牧與獸醫 ,2012，62(s1):292