低氧誘導因子-1α轉染對骨髓間充質干細胞與β-磷酸三鈣支架相容性的影響研究*

張揚，李學淵，牟怡平

（1.沈陽醫學院附屬中心醫院 手外科，遼寧 沈陽110024；2.中國醫科大學附屬第一醫院心內科，遼寧 沈陽110001）

骨缺損是骨科治療面臨的主要難題之一，目前的治療方法主要包括骨移植、二次手術內固定及人工骨填充，由于前兩者并發癥較多[1-2]，人工骨以及聯合干細胞治療越來越引起人們的重視。但由于骨缺損局部微環境處于低氧低血供的狀態，因此細胞增殖和毛細血管網再造都很困難。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，hif-1α）是1種關鍵的平衡氧穩態和調節缺氧反應的轉錄因子，其靶基因包括骨形態生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP-2）、基質細胞衍生因子 -1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、血管內皮生長因子（vescular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（vescular endothelial growth factor receptor，VEGFR）等，該因子參與細胞增生、血管生成及血紅蛋白合成等病理生理過程。因此，hif-1α轉染的骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可能通過增加組織功能骨的局部血管化、促進細胞增殖等作用改善MSCs在缺氧局部的功能并從而促進骨缺損的修復。本研究的目的主要是探討hif-1α轉染是否會對MSCs與β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）支架的相容性產生影響。

1 材料與方法

1.1 MSCs培養和鑒定

鼠齡3～4周Wistar大鼠6只，體重100～120 g，雌性，直接貼壁法分離大鼠MSCs[3]。當MSCs 70%～80%鋪滿培養瓶底時，進行傳代培養。所得細胞記為P1，同樣方法獲得P2、P3代細胞。應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD45、CD90、CD14、CD73、CD105和CD34的表達。應用成骨誘導分化條件培養液[DMEM/F12培養基，0.01 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 μmol/L維生素C，10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）]培養進行成骨細胞誘導，茜素紅染色鑒定[4]。

1.2 Hif-1α瞬時轉染

應用感受態細菌（大腸桿菌DH5α）擴增pcDNA 3.0-HIF-1α-eGFP（本實驗室保存，人HIF-1α），按質粒小提試劑盒說明書步驟操作提取質粒，核酸蛋白測定儀測定DNA濃度及純度，DNA純度為260/280 1.7～1.9，置入-20℃冰箱冷凍保存。標本送至大連TaKaRa生物公司測序[4]。應用脂質體LipofectamineTM2000將pcDNA3.0-HIF-1α-eGFP質粒轉染至MSCs[4]。轉染條件：細胞達＞80%匯合、轉染反應時間4 h、DNA和脂質體比為（μg/μl）1.00∶1.25。

1.3 MSCs轉染后穩定篩選（有限稀釋法）

瞬時轉染48 h后培養基中加入遺傳霉素（geneticin，G418）篩選，其終濃度為200 mg/L，每3～5天更換1次含有G418的篩選液。篩選7 d后胰酶消化細胞，離心，制成1 000個/ml的單細胞懸液。將獲得的細胞懸液接種于96孔板，96孔板預先除第一排外每孔加0.1 ml不含抗生素的全培養基（11%FBS）；第1排每孔加0.1 ml細胞懸液；第2排每孔加0.1 ml細胞懸液并混勻后，從中吸出0.1 ml細胞懸液，加入到第3排中；在從第3排混勻的細胞懸液中吸取0.1 ml加入到第4排孔中；以此類推，最后1排每孔中吸出的0.1 ml懸液棄去。第2天顯微鏡下觀察標記有單個細胞的孔，繼續培養，此時應用不加G418、含有青鏈霉素的全培養基，待細胞長滿后，消化傳代，移至較大培養器皿中培養。應用成骨誘導分化條件培養液（DMEM/F12培養基，0.01 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，50 μmol/L維生素C，10% FBS）培養進行成骨細胞誘導，茜素紅染色鑒定。

1.4 樣品分組

隨機選取P3代MSCs細胞（A組）和pcDNA3.0-HIF-1α-eGFP質粒穩定轉染的MSCs細胞（B組）各3瓶，與β-TCP支架共培養后觀察細胞生長和增殖情況。

1.5 細胞與β-TCP支架共培養

β-TCP支架材料加工成體積為20 mm×15 mm×15 mm大小，超聲清洗后烘干，高溫高壓滅菌備用。細胞消化，收集于15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用完全培養基重懸細胞，調整細胞濃度為2.0×107個/ml，接種到制備好的β-TCP支架上，使細胞懸液均勻浸滿整個支架材料。接種完畢，轉移細胞-材料復合物到培養皿中，放置到37℃、5%二氧化碳C02條件下的恒溫培養箱中培養，常規換液。

1.6 掃描電鏡觀察

細胞接種β-TCP支架1周后對所得的樣本進行電鏡觀察，PBS沖洗后應用2.5%的戊二醛4℃下固定1 h，梯度酒精脫水，臨界點干燥。表面噴金后，掃描電鏡下觀察。

1.7 熒光染色觀察β-TCP支架上成活細胞數

采 用 4’，6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染色法。β-TCP支架用1×PBS洗3次后用4%甲醛固定20 min，PBS沖洗2次，用100 nm的DAPI（sigma）溶液染細胞核2 min。用熒光顯微鏡拍攝圖像。每個樣品隨機要確定每個樣品上的細胞附著的水平，在同樣大的不同區域取5個細胞核的圖像，然后把每個樣品的細胞數/單位面積進行比較。

1.8 細胞增殖檢測

采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法。β-TCP支架在最佳培養條件下用3×104個/cm2密度孵育，后用PBS洗滌，再在MTT（sigma）溶液（0.5mg/ml）中孵育4 h。之后，移除MTT溶液，加入等量的二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO），低速振蕩10 min，以溶解晶體，并使溶液呈現紫色。200 μl所得溶液置于96孔板內和應用酶標儀測定在570 nm處的吸光度值。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，用配對樣本Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs形態學觀察

原代細胞接種24 h后已大部分貼壁，貼壁后MSCs呈棒狀或紡錘狀（見圖1）。1～2 d后，細胞可形成大小不等分散的細胞簇，細胞多伸展為長梭形，胞核1、2個，圓形居中，可有1個至數個核仁。2～4 d后，細胞簇增大，呈魚群樣或漩渦狀生長，與其他細胞簇逐漸融合（見圖2）。培養4～5 d可傳一代。

2.2 細胞表面抗原及細胞分化功能鑒定結果

流式細胞表面抗原檢測結果表明P3代的MSCs表達 CD90（95.5%）、CD73（95.4%）、CD105（97.9%），基本不表達 CD45（1.2%）、CD14（0.6%）、CD34（0.4%）。分離培養的MSCs經成骨誘導分化條件培養液培養后能夠成功誘導成為成骨細胞（見圖3）。

圖1 MSCs接種24 h呈棒狀或紡錘狀

圖2 MSCs培養2～4 d后，細胞簇呈魚群樣生長

圖3 MSCs成功誘導為成骨細胞 （茜素紅染色×100）

2.3 Hif-1α轉染后MSCs分化功能鑒定及熒光表達

穩定轉染Hif-1α的MSCs仍能誘導分化為成骨細胞，證明轉染后的MSCs仍保持細胞干性（見圖4）。Hif-1α瞬時轉染后12 h可見細胞有微弱熒光表達，24 h后可見綠色熒光，48 h后陽性細胞增多，熒光強度增強（見圖5）；72 h后熒光逐漸減弱。穩定轉染后可見細胞核和細胞漿內都有GFP表達（見圖6）。

2.4 在支架上生長的MSCs形態學觀察結果

在培養1周時電鏡下觀察可見細胞貼附于材料的表面，伸展性好，一些聚集在一起，有的細胞可覆蓋材料孔隙表面，生長較好，可見有突起連接并附著于孔隙內壁，并見有膠原分泌（見圖7）。

2.5 Hif-1α轉染前后β-TCP支架MSCs成活細胞數比較

隨著培養時間的延長β-TCP支架上生長的MSCs的數目也逐漸增多，在培養3 d時細胞數目增多明顯（見圖8），但在Hif-1α轉染前后MSCs在β-TCP支架上的生長細胞數差異無統計學意義（P=0.725），見圖9。

圖4 MSCs瞬時轉染Hif-1α后成功誘導為成骨細胞

圖5 MSCs瞬時轉染Hif-1α 48 h后GFP熒光蛋白表達

圖6 穩定篩選后的轉染細胞（MSCs）胞核與胞質均有綠色熒光蛋白表達 （×100）

2.6 Hif-1α轉染前后β-TCP支架MSCs增殖比較

研究結果顯示，MTT法檢測細胞增殖的結果。Hif-1α轉染前后MSCs在β-TCP支架上增殖差異無統計學意義（P=0.612）。見圖10。

圖7 生長于β-TCP支架表面的MSCs

圖8 兩組細胞在β-TCP支架的生長情況

圖9 生長在β-TCP支架上的細胞 （DAPI熒光染色）

圖10 兩組細胞增殖情況 （MTT法）

3 討論

目前，大部分研究結果提示人工骨支架、MSCs以及細胞因子聯合治療骨缺損效果最佳：BEHNIA等研究者證明應用納米骨支架聯合MSCs和富含血小板的生長因子治療兔顱骨骨缺損能夠有效促進骨再生[5]；LUCARELLI等人應用同種異體骨聯合基質干細胞和富含血小板的血漿移植治療3 cm的羊骨骼缺損，在術后4個月的隨訪時骨組織計量學分析顯示有42.8%～54.1%的新骨形成[6]；LI等人研究得出結論，應用β-TCP聯合BMP-2基因修飾的脂肪間充質干細胞治療犬尺骨骨缺損，隨訪16周時骨組織計量學分析表明聯合治療組新骨形成增加，骨缺損新骨面積/總表面積為（39.95±8.55）%[7]；HE等人使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物/磷酸鈣骨水泥聯合BMMSCs和富含血小板的血漿治療兔6 mm×10 mm股骨骨缺損，術后12周顯示聯合治療組新骨形成較好[8]；PROSECKáE等研究者證明在應用ε聚己內酯/羥磷灰石聯合MSCs和富含血小板溶液可獲得最多且分布最均勻的新生骨[9]；KIM等發現，在臨床上ε聚己內酯-磷酸三鈣聯合自體纖維蛋白膠以及MSCs和重組人BMP-2的復合材料是促進新骨形成的最佳組合[10]。在相關研究中，LIU等人的研究表明，納米羥基磷灰石/聚L-乳酸聯合牙髓干細胞和重組人BMP-2共同治療8 mm大小的兔牙槽骨的骨缺損所得骨礦物質沉積為（1.77±0.11）%，其小于應用不含重組人BMP-2的對照組，后者的骨礦物質沉積為（2.52±0.33）%[11]。聯合治療更有效的原因可能是細胞因子的應用增加細胞的生物活性和局部血管化。Hif-1α的靶基因編碼的蛋白，如VEGF、BMP-2等均在此方面具有優勢，因此可以考慮將Hif-1α引入復合組織人工骨中。

Hif-1α轉染與其他細胞因子復合相比較的優勢在于其可表達多種細胞因子，且具有穩定表達Hif-1α的干細胞可以持續且穩定的分泌細胞因子，不會因術后時間的延長而作用快速消失。而且Hif-1α能夠改善低氧環境下細胞的生物活性，對骨缺損的低氧低灌注微環境下干細胞的存活提供有利條件。本研究結果證明Hif-1α轉染前后MSCs的細胞干性和生物活性均無變化，后者與支架之間的相容性亦未受到影響，而且通過脂質體轉染的方法可以避免應用病毒轉染的繼發風險，因此應用本研究的方法合成組織人工骨是可行的。

本研究的局限性在于只證實Hif-1α轉染的MSCs用于聯合支架治療骨缺損的可行性，其有效性還需進一步研究證實。

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