強直性脊柱炎患者外周血T淋巴細胞亞群及NKT細胞的表達及意義

徐文莉，羅 藝，李 康，廖長征，林燕華，張洪德

(廣東省深圳市龍崗中心醫院中心實驗室 518116)

強直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯中軸關節的全身性、慢性、進行性炎性疾病。以骶髂關節為首發病變部位，病變可累及骶髂關節、脊柱和外周關節，以及眼、心、肺等多器官。起病大多緩慢而隱匿，男性青壯年多見，病情嚴重可致畸、致殘最后導致患者生活不能自理，而且較女性嚴重。AS在全球的患病率為0.1%～1.4%[1]。AS的病因和發病機制目前尚未完全闡明[2]，大多認為與遺傳、感染、免疫因素等有關[3-5]，但目前淋巴細胞免疫功能異常在AS中的研究備受關注[6-9]。研究發現T淋巴細胞亞群在AS發病過程起著重要的作用。自然殺傷性T細胞(NKT) 是一群既有T細胞受體又有NK細胞受體的淋巴細胞亞群，以CD3+CD16+CD56+作為NKT細胞的表面標志物，其生物學作用主要包括免疫調節和細胞毒作用，被激活后可分泌大量的細胞因子包括γ-干擾素(γ-IFN)、白細胞介素(IL)-4、IL-10、IL-13等，發揮免疫調節作用。本研究通過流式細胞術檢測AS 患者以及健康人外周血T淋巴細胞亞群及NKT細胞水平，探討T淋巴細胞亞群及NKT與AS間的關系，為AS的研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年7月至2016年7月在本院就診的AS患者69例作為病例組，其中男35例，女34例，年齡19～53歲。AS診斷符合1984年美國紐約修訂標準[10]。人類白細胞抗原B27(HLA-B27)陽性40例，HLA-B27陰性29例。所有患者未接受藥物治療，排除哺乳期、腫瘤病史、近期感染或任何其他慢性炎癥疾病患者。另選擇同期體檢健康者22例作為健康對照組，其中男13例、女9例，年齡18～51歲，排除標準同上。兩組受試者性別及年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 儀器：FACSCantoⅡ流式細胞儀(美國BD公司)，德國Eppendorf 5702R臺式離心機，TYXH-Ⅰ-旋渦混合器(上海豫明儀器有限公司)。試劑：硫氰酸熒光素(FITC)-CD3抗體、藻紅蛋白花青苷7(PE-Cy7)-CD4抗體、別藻藍蛋白花青苷7(APC-Cy7)-CD8抗體、藻紅蛋白(PE)-CD16抗體、藻紅蛋白(PE)-56抗體、HLA-B27檢測試劑盒(HLA-B27Kit)、同型對照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE-Cy7、IgG1-APC-Cy7、IgG-PE、流式細胞儀7色校準微球(BD FACS 7-ColorSetup Beads)、紅細胞裂解液/溶血素、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購于美國BD公司。

1.3HLA-B27、淋巴細胞亞群、NKT細胞檢測標本制備 采集受試者空腹靜脈血1 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，4 h內完成流式細胞儀檢測。HLA-B27：采用BD公司的FACSCantoⅡ流式細胞儀及配套試劑檢測HLA-B27，以試劑設定的Mark值為界值，小于Mark值為陰性，反之為陽性。淋巴細胞亞群和NKT細胞標本制備：取50 μL的全血與20 μL的抗體混勻，避光15 min，加450 μL的溶血素混勻，避光15 min，運行FACS Diva 軟件，將標本置于上樣盤中依次收集標本，同時設空白、同型對照，每例收集2×104個細胞，結果用百分比表示。

2 結 果

2.1AC患者與健康對照組T淋巴細胞亞群及NKT細胞檢測結果比較 與健康對照組比較，AS患者CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；CD8+T細胞、NKT細胞表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1和表1。

2.2HLA-27陽性組與陰性組外周血T淋巴細胞亞群及NKT細胞檢測結果比較 與HLA-27陰性患者比較，HLA-27陽性患者CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值升高，CD8+T細胞、NKT細胞表達水平降低，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖2和表2。

注：A為健康對照組CD4+、CD8+T細胞表達；B為健康對照組NKT表達；C為病例組CD4+、CD8+T細胞表達；D為病例組NKT表達

圖1流式細胞術檢測病例組與健康對照組T淋巴細胞亞群及NKT細胞

注：A為HLA-27陽性組CD4+、CD8+T細胞表達；B為HLA-27陽性組NKT表達；C為HLA-27陰性組CD4+、CD8+T細胞表達；D為HLA-27陰性組NKT表達

圖2 流式細胞術檢測HLA-27陽性組與陰性組 T淋巴細胞亞群及NKT細胞表1 病例組及健康對照組T淋巴細胞亞群及NKT細胞檢測結果比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05

表2 HLA-27陽性組與陰性組T淋巴細胞亞群及NKT細胞檢測結果比較

3 討 論

AS的發病與HLA-B27分布一致，北方多于南方，多數在青少年晚期和20歲以前發病。迄今AS的確切發病機制尚未研究透徹，但是隨著免疫學動物模型的研究與分子生物學技術的發展，發現免疫紊亂在AS發病機制起到重要作用。本研究結果顯示，AS患者外周血中CD4+、CD8+T細胞表達水平及CD4+/CD8+高于健康對照組；NKT細胞表達水平低于健康對照組，提示T淋巴細胞及NKT細胞參與了AS疾病的發展。研究表明Th1/Th2細胞比例失衡在AS發病中具有重要作用[11-12]，NKT細胞經激活后可分泌大量的細胞因子，參與對機體的免疫調控作用，可同時分泌Th1/Th2型細胞因子，其中包括IL-4可能影響Th1/Th2細胞免疫平衡。已證實IL-4是調控Th2細胞反應的關鍵細胞因子，NKT細胞的一個顯著特點是受刺激后能夠很快產生大量的IL-4，而AS患者特征是NKT細胞數量減少，分泌IL-4能力下降，抑制Th2細胞的發育，從而導致Th1細胞免疫功能增強，引發疾病。此外，NKT細胞可以有效清除凋亡小體，從而抑制自身反應性B細胞的激活，而本研究顯示AS患者NKT細胞數量降低，導致B細胞活化，使患者體液免疫反應狀態活躍，故引發疾病。

AS患者HLA-B27陰性率小于10%，發病機制可能與HLA-B27陽性不同，其淋巴細胞表達是否存在不同，目前研究較少。本試驗從HLA-B27陽性、陰性2個方面研究，結果顯示二者之間CD4+、CD8+T細胞表達水平及CD4+/CD8+和NKT細胞表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，提示HLA-B27抗原存在與否對CD4+、CD8+細胞及NKT細胞水平的影響不大。

綜上所述，NKT細胞表達水平對AS發生起著重要作用，進一步研究NKT細胞參與AS的發生機制，有可能為AS的診斷與治療提供依據，并有望成為臨床治療的靶點以及療效評價指標。

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