不同電針法對APP/PS1小鼠海馬高遷移率族蛋白B1和白細胞介素-10表達的影響①

趙江豪，姚海江，王遠征，盧夢晗，李昱頡，宋萌，楊利娟，劉俊彤，李志剛

1.北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京市100029；2.中國康復研究中心北京博愛醫院中醫治療中心，北京市100068；3.首都醫科大學康復醫學院，北京市100068；4.北京大學第一醫院中西醫結合科，北京市100084

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)也稱“老年性癡呆”，起病隱匿，以老年人(包括老年前期)為多發人群，是一種以認知、記憶能力持續受損和人格改變等為特征的中樞神經系統(central nervous system,CNS)退行性疾病[1]。AD是癡呆發病的最主要類型，在中國可占全部癡呆人群的50%～70%[2]。慢性炎癥反應是AD發病過程中的重要病理表現之一[3-4]。小膠質細胞(microglia,MG)作為CNS的天然屏障，是重要的免疫細胞，在AD的病理發展過程中起著推波助瀾的重要作用：MG的過度活化，可釋放大量致炎蛋白因子，介導神經炎癥反應，促使神經元持續受損[5-6]。非甾體類消炎鎮痛藥可降低AD的風險，減緩疾病進展，進一步佐證炎癥反應與AD發病之間存在著密切關系[7-8]。

大量研究證實[9-10]，電針對AD有效。本研究從MG活化角度出發，選取與AD反應密切相關的高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein-1,HMGB1)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)，探討分析不同電針在“通督啟神”針法下對AD治療效果的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7月齡SPF級健康雄性黑色雙轉基因APP/PS1小鼠32只，購于南京大學南京生物醫藥研究院模式動物研究所，批準號SCXK(寧)2010-0001，體質量(24.6±4.3)g。飼養于北京中醫藥大學動物中心屏障系統單籠。根據小鼠體質量標號，隨機數字表法分為模型組、藥物組、脈沖電針組及音樂電針組各8只；選擇8只同月齡相同背景的C57BL/6小鼠作為正常對照組。

1.2 主要試劑與儀器

ZYTH2013030504無菌針灸針，直徑0.25 mm、長13 mm：北京中研太和醫療器械有限公司。ZJ-12H音樂電針治療儀：深圳市圣祥高科技有限公司。HANS-202型韓式電針儀：南京濟生醫療科技有限公司。XR-XM101型Morris水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統：上海欣軟信息科技公司。自制小鼠束縛套，約8×4 cm，頭部用雙層紗布縫制。電泳儀：美國BIO-RAD公司。離心機：美國THERMO公司。BX53光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司。石蠟切片機：德國LEICA公司。

二甲苯(分析純)：北京化學試劑公司。兔抗HMGB1多克隆抗體、大鼠抗IL-10單克隆抗體：英國ABCAM公司。

1.3 方法

脈沖電針組小鼠用束縛套固定，參照實驗動物針灸穴位圖譜，交叉平刺百會、印堂，兩針針體不接觸，以防短路，深約0.5 cm，針柄接韓式電針儀，頻率2 Hz，強度以小鼠頭部稍稍顫動為宜，每次20 min，后點刺人中。每天上午9:00治療1次，共15 d。

音樂電針組小鼠同法束縛、針刺，選取節奏明朗的癡呆處方干預，以小鼠保持安靜不暴躁掙扎為度。

藥物組予鹽酸多奈哌齊0.92 mg/kg灌胃給藥。

正常對照組、藥物組和模型組同法抓取并用相同鼠套束縛20 min。

1.4 Morris水迷宮檢測

Morris水迷宮水深約29 cm，水溫(22±2)℃，加入低糖低脂奶粉使水成為半透明乳白色，以利于攝像分辨為度。水池內水面平均分為4個象限，平臺放置于第三象限中央，水面下1 cm。水池上方裝備攝像機，將所采集信號傳入計算機分析軟件系統，進行圖像和數據自動采集和處理。

1.4.1 定位航行實驗

在水迷宮實驗前一天，撤離平臺，小鼠在水池內游泳訓練90 s。正式實驗時，小鼠入水前先將其放在平臺上10 s令其熟悉環境；以第一象限池壁中央為入水點，面朝池壁放入水中。小鼠登臺停留5 s，自動記錄逃避潛伏期；若90 s內小鼠未能登上平臺，則逃避潛伏時記為90 s。共測試5 d。

1.4.2 空間探索實驗

定位航行實驗結束后，拆除平臺，將小鼠分別從第一、二、四象限池壁中點相同方法放入池中，記錄90 s內小鼠在原平臺所在象限的游泳時間與游泳總時間之比。

1.5 HMGB1與IL-10檢測

1.5.1 Western blotting

水迷宮測試完畢后，各組隨機取4只小鼠，10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉，斷頭處死，取出腦組織，冰袋上分離出大腦海馬，存置于滅菌凍存管。將液氮中組織取出，加入蛋白裂解液，測定蛋白含量，取樣本30μg，10%SDS-PAGE電泳，半干電轉移儀轉印至PVDF膜上，5%TBS-T脫脂奶粉封閉震蕩60 min，加入 HMGB1 抗體(1∶100)或 IL-10 抗體(1∶2000)4℃孵育過夜。第2天洗膜，加二抗(HMGB1 1∶100，IL-10 1∶2000)37℃震蕩孵育1 h；加發光液，曝光后顯影清晰時漂洗定影，晾干掃描。用Image-Pro Plus軟件對目的條帶進行灰度分析，以目的蛋白與β-actin的相對灰度值表示。

1.5.2 免疫組化染色

將其余4只小鼠10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，左心尖插入針頭固定，剪開右心耳，以生理鹽水灌注至流出液體清亮，肝臟灰白色；換4%多聚甲醛繼續灌注至小鼠軀干、四肢及尾部全部僵硬，取全腦，置4%多聚甲醛中，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片。切片脫蠟，枸椽酸水煮抗原修復10 min，PBS漂洗3遍。3%H2O2常溫保濕盒中10 min，PBS漂洗；正常非免疫羊血清室溫保濕盒中孵育10 min；加兔抗HMGB1多克隆抗體(1∶1100)或鼠抗IL-10單克隆抗體(1∶50)，4℃冰箱孵育過夜；第2天PBS漂洗，HMGB1使用生物素標記的羊抗兔IgG二抗，IL-10使用生物素標記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育10 min，PBS漂洗；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶37℃孵育10 min，PBS漂洗；DAB顯色，顯微鏡下觀察并適時終止顯色；蘇木素復染(HMGB1不復染)，酒精梯度脫水，中性樹脂封片。以海馬CA1部分為圖片分析區域，每組取相互不重疊的6個視野，Image-Pro Plus軟件分析系統計數陽性細胞數。

1.6 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行處理。各數據均以(xˉ±s)表示，水迷宮逃避潛伏期采用重復測量方差分析，水迷宮空間探索測試實驗和Western blotting數據呈正態分布，采用單因素方差分析，組間比較選用LSD檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

定位航行實驗隨著訓練時間增加，各組逃避潛伏期呈下降趨勢。與正常對照組比較，模型組逃避潛伏期較長(P＜0.05)。前兩天藥物組、脈沖電針組和音樂電針組均與模型組無顯著性差異(P＞0.05)，第3天音樂電針組與模型組有顯著性差異(P＜0.05)，第4天以后正常對照組、藥物組、脈沖電針組、音樂電針組與模型組均有顯著性差異(P＜0.05)，正常對照組逃避潛伏期最短，其次是音樂電針組、脈沖電針組、藥物組，模型組最長。見表1。

空間探索實驗中，正常對照組目標象限游泳時間比值最高，而后依次是音樂電針組、脈沖電針組、藥物組，模型組最低。音樂電針組與脈沖電針組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較(s)

表2 各組目標象限游泳時間與總時間之比的比較

2.2 Western blotting

與正常對照組比較，模型組HMGB1蛋白表達增加(P＜0.05)；與模型組相比，脈沖電針組和音樂電針組的蛋白表達下降(P＜0.05)；音樂電針組比脈沖電針組無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖1。

與正常對照組比較，模型組IL-10蛋白減少(P＜0.05)；與模型組相比，脈沖電針組和音樂電針組的IL-10蛋白表達上升(P＜0.05)；音樂電針組比脈沖電針組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組海馬IL-10表達(Western blotting)

2.3 免疫組化染色

正常對照組小鼠海馬CA1區HMGB1陽性細胞表達數量最少(P＜0.001)，模型組相同腦區表達最多，主要表達于胞漿和胞外。與模型組比較，脈沖電針組和音樂電針組HMGB1陽性細胞表達下降(P＜0.05)，音樂電針組表達少于脈沖電針組(P＜0.05)。見表4、圖3。

正常對照組小鼠海馬CA1區IL-10表達最多，模型組表達最少(P＜0.001)，主要為胞質，胞核少量著色。與模型組比較，脈沖電針組和音樂電針組IL-10表達增多(P＜0.05)，音樂電針組表達多于脈沖電針組(P＜0.05)。見表4、圖4。

表3 各組海馬HMGB1與IL-10表達比較

表4 各組海馬HMGB1與IL-10陽性細胞數比較

圖3 各組海馬HMGB1表達(免疫組化染色,bar=50μm)

圖4 各組海馬IL-10表達(免疫組化染色,bar=50μm)

3 討論

研究顯示，由于β淀粉樣蛋白(betaamyloid,Aβ)沉積引發MG過度活化，其誘發的神經炎癥反應在AD神經元凋亡過程中發揮重要作用，可能是AD的發病機制之一[11-12]。MG作為CNS的免疫細胞，具有“雙刃劍”效應，既可以監測腦內微環境，抵抗各種損傷，發揮吞噬凋亡細胞碎片的作用；又可誘導、加重CNS炎癥反應，從而加速AD發展，加劇神經元破壞和凋亡[13]。MG可在Aβ沉積以及Tau磷酸化等的刺激下，呈M1型極化，胞體發生阿米巴樣形態轉化，正常吞噬功能減弱，分泌大量致炎因子。MG還具有拮抗炎癥反應的M2型極化，大量分泌IL-10、IL-4、IL-13以及轉化生長因子-β等，抑制抗炎因子表達，發揮營養和修復作用。

在Aβ持續激活下，MG從靜息狀態下過度活化、聚集，喪失生理警戒和抵御功能，過度產生的炎性介質加劇神經炎癥，造成嚴重神經毒性，侵蝕損傷神經元，甚至導致其凋亡[14]。激活的MG和死亡的神經元可以釋放HMGB1，HMGB1又作用于MG，促進促炎癥因子或氧自由基釋放，誘發級聯放大效應，加重神經炎癥，加重認知功能障礙及記憶力減退[15]；同時，HMGB1可以與Aβ結合，形成較難降解的Aβ寡聚體，抑制MG對Aβ的清除[16]。

IL-10作為主要抗炎細胞因子之一，在降低促炎性細胞因子表達的同時，還能促進Aβ清除，從而減輕Aβ誘導的AD樣變化[17-18]。

“通督啟神”法以百會、印堂、人中三穴作為主穴。該法基于“腦為髓海”，又為元神之府，而“督脈者……上額，交巔，入絡腦”，根據腦、神、督脈之間密切聯系提出，在治療精神神志類疾病中取得明顯效果。百會是六陽經與督脈交會穴，可調全身神識，為調神第一大穴。葉濤等[19]的研究顯示，電針百會可有效改善腦缺血再灌注造成的腦神經損傷。宋長明等[20]的研究證實，電針百會、神庭穴可改善再灌注損傷后大鼠學習記憶能力，并能改善模型大鼠腦內超微結構。印堂居眉心正中，功能鎮驚醒神，降逆除煩。人中又名水溝，可溝通陰陽，為急救要穴，主醒神開竅，為諸多神經精神疾患要穴。三穴配合，可以達到“通督啟神”的療效。

音樂電針以電流輸出波形模擬音樂節奏的低中頻電刺激，電流如音樂般頻率和振幅不斷變換，避免機體過度適應和耐受。音樂電針不僅具有刺激腧穴和音樂節奏治療的雙重作用，而且克服了以往普通脈沖電針易產生耐受性的缺點，在治療焦慮、抑郁等神經精神疾病中取得很好效果[21-22]。

我們前期研究已經證實，“通督啟神”法兩類電針能夠降低癡呆小鼠腦內Aβ含量，進而改善其癡呆行為[23-24]。本研究顯示，在改善AD模型小鼠空間記憶方面，音樂電針組逃避潛伏期自訓練第3天起即明顯少于模型組，而脈沖電針組和藥物組則在第4天起少于模型組；音樂電針組逃避潛伏期少于脈沖電針組。目標象限游泳時間與總游泳時間之比也有相似的傾向。提示“通督啟神”電針可改善APP/PS1小鼠空間記憶，且音樂電針優于脈沖電針，與本課題以往研究一致[25]。“通督啟神”電針均可降低AD小鼠海馬HMGB1的表達，增加IL-10表達，音樂電針更為明顯。

總之，本研究提示，“通督啟神”兩種電針均為行之有效改善AD的手段，且音樂電針干預效果更優，其作用機制可能與其影響促炎因子HMGB1及抗炎因子IL-10，干預MG兩種不同極化有關。但其具體作用機制尚需要進一步研究。

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