電針百會、神庭穴對缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)嘌呤受體P2X7表達(dá)的影響①

黃佳，宋長明，楊敏光，李建鴻，黃盛，柳維林，陶靜,2,3，陳立典,2,3,4

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市350122；2.福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建福州市350122；3.康復(fù)醫(yī)療技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州市350122；4.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心，福建福州市350122

腦卒中是全球第二大致死病因及成人致殘的首要原因。在一些發(fā)達(dá)國家，67.3%～80.5%的腦卒中歸因為缺血性腦卒中[1-2]。認(rèn)知功能障礙是學(xué)習(xí)記憶、言語、表達(dá)、理解、計算等能力的缺失。腦卒中后認(rèn)知障礙發(fā)生率達(dá)47.3%[3]，嚴(yán)重影響腦卒中患者日常生活，阻礙患者全面康復(fù)。臨床研究表明，針刺可改善患者的認(rèn)知功能[4]。本課題組通過動物實驗和臨床試驗研究均證明電針百會、神庭穴在改善認(rèn)知障礙方面有一定作用[5-8]。

海馬是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，CA1區(qū)神經(jīng)元對結(jié)構(gòu)蛋白損害和能量障礙特別敏感；腦缺血缺氧或炎癥等損傷易引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及突觸丟失，導(dǎo)致記憶障礙，特別是空間記憶受損[9-12]。

嘌呤受體與海馬密切相關(guān)[13-14]。嘌呤受體可分為P1和P2兩大類，P2受體的配基是嘌呤核苷酸。P2受體又分為兩類：離子通道P2X受體和G蛋白偶聯(lián)P2Y受體。P2X7受體在海馬神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)[15]。研究表明[16-18]，腦卒中后，受損神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞迅速釋放ATP，激活膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體；P2X7受體通過自身膜孔道結(jié)構(gòu)或激活下游信號通路，促進(jìn)炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6產(chǎn)生和釋放；炎癥介質(zhì)進(jìn)一步上調(diào)P2X7受體表達(dá)，并增加其對細(xì)胞外ATP的敏感性，從而加速炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元死亡。側(cè)腦室注射P2X7受體特異性抑制劑后，能有效保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元，改善腦缺血再灌注大鼠空間記憶能力[19-20]。

本研究觀察腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)P2X7受體表達(dá)，探討電針治療認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠42只，體質(zhì)量230～260 g，購于上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002；由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號SYXK(閩)2012-001。每籠5只，自由進(jìn)食及飲水。

所有實驗均遵照國際動物保護(hù)和使用指南的規(guī)定實施。

1.2 主要試劑和儀器

P2X7受體抗體(11144-1-AP)：美國PROTEINTECH公司。 大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(F15810)、大鼠TNF-α ELISA試劑盒(F16960)：上海西唐生物科技有限公司。3600A線栓：廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。華佗牌G6805型電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。Barnes迷宮：上海欣軟信息科技有限公司。DMI4000B熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)：德國LEICA公司。Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、Image-lab圖像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD LABORATORIES公司。

1.3 造模與分組

隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(n=12)和手術(shù)組(n=30)。手術(shù)組參考Longa法[21]制備左側(cè)大腦缺血再灌注動物模型。大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒頸部皮膚，頸正中切口，暴露左側(cè)頸總動脈，向上分離并暴露左側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈；結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，用血管夾夾閉頸內(nèi)動脈。在頸總動脈結(jié)扎處約3 mm處剪一小口，將線栓插入；撤去血管夾，緩慢推送線栓至大腦中動脈分支處，稍有阻力時停止，線栓距動脈分叉約18～20 mm；結(jié)扎頸內(nèi)動脈固定線栓，清洗縫合創(chuàng)口。90 min后，緩慢抽出線栓，剪斷體外多余線拴。

假手術(shù)組分離動脈，不予結(jié)扎和插線。

術(shù)中、術(shù)后注意保暖，置于25℃環(huán)境下蘇醒。

動物蘇醒后，按Longa評分判斷模型是否成功。評分l～3分者入組實驗。最終納入24只大鼠，分為模型組、電針組各12只。

1.4 方法

造模成功后第2天，電針組采用自制捆綁法固定，參考《實驗針灸學(xué)》[22]定位方法取百會、神庭。斜刺，深2 mm左右。接電針儀，疏密波，頻率2/20 Hz，強(qiáng)度1～3 mA。每次30 min，每天1次，共7 d。假手術(shù)組和模型組同等條件抓取，不予任何治療。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 神經(jīng)行為學(xué)評分

造模后2 h和干預(yù)后1 d、3 d、7 d對各組大鼠行Longa評分。

1.5.2 Barnes迷宮測試

干預(yù)后3 d，采用Barnes迷宮測試大鼠空間記憶功能。迷宮由直徑122 cm的圓形平臺構(gòu)成，四周分布20個洞口，洞口直徑10 cm。逃避盒放在其中一個洞口的底部。檢測前把大鼠置于逃避盒內(nèi)30 s；風(fēng)吹以及噪聲等干擾刺激作為大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞口的動機(jī)。實驗時，大鼠置于圓形平臺的中央起始盒內(nèi)，電子跟蹤設(shè)備記錄其在300 s內(nèi)找到正確洞口所用的時間(逃避潛伏期)和進(jìn)入錯誤洞口的次數(shù)，共5 d。每次測試完畢后旋轉(zhuǎn)圓形平臺，并用70%酒精紗布擦拭清洗，以防通過嗅覺找到目標(biāo)洞口。洞口位置保持不變。

1.5.3 免疫熒光檢測

干預(yù)7 d后，各組取6只大鼠經(jīng)腹腔靜脈放血，前正中線剪開，心尖部及右心耳各剪開一個小口，用磨鈍針頭從心尖部插入心臟，進(jìn)入頸動脈并固定，同時夾緊腹主動脈防止灌注液體進(jìn)入下腔循環(huán)。用生理鹽水300 ml快速沖洗，待流出血液呈較淡的粉紅色停止。4%多聚甲醛緩慢灌注約400 ml，至大鼠前肢僵硬且輕微抽搐，頭部堅硬停止。斷頭取腦，完整取出置4%多聚甲醛中常溫固定，石蠟包埋，切片。

微波修復(fù)后，5%胎牛血清封閉，37℃孵育90 min。滴加P2X7受體一抗(1∶50)，4℃冰箱孵育過夜；次日用PBS沖洗3次，每次5 min。滴加熒光二抗，37℃避光孵育90 min，PBS清洗3次，每次5 min?？篃晒獯銣缣幚砑胺馄?含DAPI)，風(fēng)干后，立即用熒光倒置顯微鏡100倍下觀察，Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析，記錄平均光密度(optical density,OD)。

1.5.4 ELISA

干預(yù)7 d后，各組另6只大鼠腹主動脈放血，只灌注生理鹽水，其他過程同上。冰上迅速取出大腦組織并用生理鹽水沖洗干凈，分離出左側(cè)大腦海馬CA1區(qū)，置于EP管內(nèi)，迅速投入液氮罐中；保存于-80℃冰箱。

將海馬CA1區(qū)組織稱質(zhì)量，加入10μl/mg蛋白酶抑制劑，充分研磨，4℃下3000 r/min離心20 min，取上清。按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀計算IL-1β、TNF-α含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用(xˉ±s)表示。神經(jīng)功能缺損評分不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗獨立樣本成對比較。逃避潛伏期、進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)、嘌呤受體P2X7平均OD值、IL-1β和TNF-α的含量均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊者用LSD法，方差不齊用Games Howell法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評分

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損；干預(yù)前，模型組和電針組間神經(jīng)行為學(xué)評分無顯著性差異(P＞0.05)；模型組和電針組Longa評分逐漸下降；干預(yù)后7 d，電針組較模型組降低(P＜0.05)。見表1。

表1 各組Longa評分比較

2.2 Barnes迷宮測試

干預(yù)7 d后，與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期顯著延長(P＜0.001)，進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)顯著增多(P＜0.001)；與模型組相比，電針組逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.001)，進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)顯著減少(P＜0.001)。見表2。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠軌跡分散于四周，雜亂；與模型組相比，電針組大鼠軌跡較集中，能較迅速找到目標(biāo)洞口。見圖1。

2.3 IL-1β、TNF-α表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，電針組IL-1β、TNF-α降低(P＜0.05)。見表3。

表2 各組Barnes迷宮測試結(jié)果比較

2.4 P2X7受體表達(dá)

假手術(shù)組P2X7受體平均光密度值顯著低于模型組(P＜0.001)；與模型組相比，電針組P2X7受體表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。見表3。模型組P2X7受體表達(dá)散亂，電針組表達(dá)較規(guī)整。見圖2。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)P2X7受體、IL-1β和TNF-α表達(dá)

圖1 干預(yù)7 d各組尋找目標(biāo)洞口軌跡圖

圖2 干預(yù)7 d各組海馬CA1區(qū)嘌呤受體P2X7表達(dá)(免疫熒光染色，100×)

3 討論

腦卒中后認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為記憶力減退、執(zhí)行功能障礙、注意力障礙、判斷力和抽象思維損害。督脈聯(lián)絡(luò)腦及臟腑，總督一身陽脈之氣，與神志密切相關(guān)。督脈調(diào)暢，腦髓得以濡養(yǎng)，神機(jī)靈透，肢體活動自如；若督脈虧虛，髓海失充，則神明失用。百會為“三陽五會”，位居巔頂；頭為諸陽之會，百脈之宗，百會穴則為各經(jīng)脈氣會聚之處。神庭是督脈、陽明經(jīng)、足太陽交匯之穴，為神志所在，其功在神。針刺督脈穴位百會、神庭有醒腦開竅、安神定志、增強(qiáng)記憶之功。

針刺可以改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。李夢瑤等[23]發(fā)現(xiàn)，電針能讓局灶性腦缺血再灌注大鼠血中內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞含量增加，并能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。皮敏等[24]研究表明，電針督脈穴位能改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能。梁超等[25]發(fā)現(xiàn)，不同變頻組合電針頭穴預(yù)處理能減輕腦缺血后大鼠神經(jīng)功能損傷。本研究顯示，電針百會、神庭穴能夠有效緩解腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。

針刺也能改善大鼠的認(rèn)知功能障礙。蔡麗等[26]針刺百會、四神聰?shù)妊?，針刺組記憶功能顯著提高。陳彬等[27]發(fā)現(xiàn)，針刺能改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

Barnes迷宮對動物應(yīng)激性刺激較小，不需要食物剝奪和足底電擊，既不需要像放射臂迷宮那樣禁食，也不需要像水迷宮那樣強(qiáng)應(yīng)激，且能排除Morris水迷宮等測試中大鼠肢體運動功能障礙對實驗的影響，有較高認(rèn)可度。本研究顯示，電針可以降低腦缺血再灌注大鼠逃避潛伏期，減少其進(jìn)入錯誤洞口次數(shù)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

細(xì)胞外ATP激活P2X7受體促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生和釋放，是一條公認(rèn)的炎癥相關(guān)通路。有研究表明[28]，針刺對嘌呤受體有一定調(diào)控作用。電針治療可下調(diào)脊髓嘌呤受體表達(dá)，減輕結(jié)腸免疫反應(yīng)，減輕內(nèi)臟痛覺敏感性[29-30]。Burnstock[28]發(fā)現(xiàn)，在中腦水管周圍灰質(zhì)區(qū)，電針對脊椎的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與嘌呤受體活化密切相關(guān)；在脊髓背根神經(jīng)元中，電針通過調(diào)控嘌呤受體，提高慢性神經(jīng)性疼痛大鼠的痛閾。本研究表明，電針百會、神庭穴可有效抑制腦缺血再灌注大鼠P2X7受體表達(dá)。

本課題組前期研究表明，電針可能通過調(diào)控Toll樣受體-4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路，抑制缺血周圍皮質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放[5,31-32]。有研究顯示[33-34]，針刺百會、大椎7 d，也能有效抑制治療腦缺血再灌注大鼠缺血皮質(zhì)半暗帶TNF-α表達(dá)，改善神經(jīng)功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，電針百會、神庭穴可有效抑制腦缺血再灌注大鼠炎性因子IL-1β、TNF-α表達(dá)。

綜上所述，電針百會、神庭穴能夠改善腦缺血再灌注大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與抑制嘌呤受體P2X7表達(dá)，降低炎性因子IL-1β、TNF-α水平，改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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