電針神庭、百會對腦缺血再灌注大鼠認知功能及Beclin-1表達的影響①

馮曉東，史景，灣明月，劉承梅

河南中醫藥大學第一附屬醫院康復中心，河南鄭州市450000

認知障礙在腦卒中患者中發病率達56.6%[1]，嚴重影響腦卒中患者的整體功能恢復和身心健康[2]。針刺百會、神庭穴可以改善腦卒中患者的學習記憶能力[3]，其具體作用機制并未完全闡明。

自噬(autophagy)是真核細胞通過代謝和分解其自身蛋白質或衰老細胞器，并進一步消化和再利用的生物過程[4]。在缺血缺氧等應激狀態下，神經細胞死亡率高，自噬激活明顯提高細胞存活率，認為應激狀態下自噬對神經細胞產生保護作用[5-7]。Beclin-1作為自噬標記物，是衡量自噬發生程度的方法之一[8]。本研究制備大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)腦缺血再灌注大鼠模型，觀察電針神庭、百會穴對MCAO大鼠學習記憶能力、腦梗死體積以及Beclin-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠45只，體質量(260±20)g，由鄭州大學實驗動物中心提供，合格證號41003100004006。飼養在河南省中醫院中心實驗室的獨立通風籠具中，每籠5只，予自由飲食、飲水，適應性飼養1周。實驗過程嚴格按照國際動物保護和使用指南的規定進行。

1.2 實驗試劑和儀器

水合氯醛(30037516)：鎮江德為化學品有限公司。2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色液(G3005-100)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020-500)、10×麗春紅染液(P0012-10)：北京索萊寶科技有限公司。FITC山羊抗兔IgG(h+1,SA00003-2)：武漢三鷹生物技術有限公司。GAPDH抗體(GTX100118-S)、Beclin-1抗體(GTX55535)：美國GENETEX公司。

Morris水迷宮(XR-XM101)：上海欣軟信息科技有限公司。G6805電針儀：上海華誼醫用儀器有限公司。華佗牌30號0.5寸毫針：蘇州醫療用品廠。

1.3 分組和造模

大鼠以隨機數字表法分成假手術組、模型組、電針組，各15只。術前動物禁食24 h。稱重后，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉，參造Longa法[9]建立左側MCAO模型。分離并暴露左頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，依次結扎頸總動脈近心端、頸外動脈遠心端，并于頸總動脈分叉處近心端預留結扎線。微動脈夾夾閉遠端頸內動脈，距頸總動脈分叉處1 mm處用顯微剪刀剪一切口，將已備好的線栓插入頸內動脈，插入長度約18～22 mm，至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈血供。縛緊預先放置于頸總動脈的結扎線。常規縫合消毒，4-0縫合線縫合傷口。縫合時皮膚外留線栓1 cm。2 h后，輕柔回抽線栓至頸總動脈分叉處。

術中保持室溫25℃左右，白熾燈照射動物以保持肛溫[9]。實驗過程中密切觀察大鼠變化，注意動物保溫。

假手術組只分離血管，不結扎和插入栓線。

動物完全蘇醒后，Longa法行神經行為學評分。0分，無神經缺失的癥狀；1分，不能完全伸展對側前爪；2分，向外(右)側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，神經缺失嚴重，意識喪失，不能自發行走[9]。0分、4分大鼠予以排除。合格大鼠放回籠中正常飼養。

1.4 方法

術后2 h，電針組參考《實驗針灸學》取大鼠神庭和百會穴，用華佗牌30號0.5寸毫針，神庭穴向上斜刺，深2 mm；百會穴向前斜刺，深2 mm。接G6805-2A電針儀，電壓峰值6 V，以鼠耳輕輕抖動為度，疏密波，頻率1～20 Hz。每次30 min，每天1次，共7 d[10]。假手術組和模型組造模后回籠飼養，予同等條件抓取。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經行為學評分

術后每天同一時間采用Longa評分進行評定，記錄術后1 d、3 d、5 d、7 d的評分進行比較。

1.5.2 Morris水迷宮檢測

術后4 d起連續訓練4 d。水迷宮直徑160 cm，深55 cm，水深30 cm，水溫22～26℃；池壁上4個等距離點分水池為4個象限，任選一象限中央放置平臺，平臺直徑12 cm，高28 cm，沒于水面下2 cm。池壁外標4個入水點，水池周圍參照物保持不變。

1.5.2.1 定位航行實驗

連續訓練4 d，每天訓練4次，分別從4個象限入水點將大鼠放入水中。如果大鼠在90 s內爬上平臺，并停留3 s以上，則認為大鼠找到平臺，此為逃避潛伏期。如果90 s內大鼠未能找到平臺，則拖拽其尾部，將其引導到平臺，熟悉10 s，潛伏期計為90 s。每次訓練間隔5 min。取4個方向潛伏期的平均數作為該日成績。

1.5.2.2 空間探索實驗

測試第5天上午，撤去平臺，取任意入水點將大鼠放入水中，觀察并記錄90 s內大鼠穿過原平臺區域的次數[10]。

1.5.3 TTC染色

治療7 d結束后，各組取5只動物斷頭處死，生理鹽水灌注，取腦，腦組織迅速置于-20℃冰箱冷凍20 min，至腦組織變硬。從大腦半球額極到枕極做連續冠狀位切片，厚約2 mm，共6片。腦片放入2%TTC溶液中，37℃恒溫箱15～30 min，并不時翻動腦片，使腦片均勻接觸染色液。整個過程注意避光。Image-Pro Plus 6.0軟件測量腦梗死面積和大腦面積，計算腦梗死體積百分比

1.5.4 Western blotting

治療7 d結束后，各組取5只動物斷頭處死取腦。取大鼠大腦海馬組織，置液氮罐中速凍，再置-80℃冰箱保存。取大鼠腦組織200 mg，加裂解緩沖液2 ml，15,000 r/min 4℃離心15 min后取上清。BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調為一致。取樣品20 ml煮沸5 min，120 V、50 mA電泳1.5 h；將凝膠取出，80 V、100 mA轉印2 h至PVDF膜。取出，麗春紅預染，證實蛋白質確實轉移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBS洗2次，每次5 min。分別加入兔Beclin-1單克隆抗體和內參抗體GAPDH孵育(均1∶4000)，4℃過夜。TBST洗2次，每次5 min。加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG(1∶3000)，室溫2 min。TBST洗2次，每次5 min。將濾膜放入配好的顯色液，ECL法發光，于化學發光成像系統中成像，Image Lab軟件檢測條帶灰度值，取Beclin-1與GAPDH相對灰度進行半定量分析。

1.6 統計學分析

應用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。計量資料以(xˉ±s)表示。Longa評分不符合正態分布，在模型組與電針組間進行秩和檢驗。其他多組計量資料符合正態分布，進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較，若方差齊者用LSD法，方差不齊則用Games-Howell法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 神經行為學評分

造模大鼠30只全部成功。造模后1 d模型組死亡1只。與模型組比較，電針組Longa評分術后1 d無顯著性差異，3 d、5 d、7 d低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組Longa評分比較

2.2 Morris水迷宮檢測

定向航行實驗結果表明，隨著時間推移，各組逃避潛伏期逐漸縮短，電針組少于模型組(P＜0.05)。空間探索實驗，電針組穿越平臺次數多于模型組(P＜0.05)。見表2、表3。

表2 各組逃避潛伏期比較(s)

表3 各組穿越平臺次數比較

2.3 腦梗死體積

與模型組比較，電針組腦梗死體積占全腦百分比(6.59±0.94)%，顯著小于模型組(28.04±4.89)%(F=7.651,P＜0.001)。

2.4 Western blotting

與假手術組比較，模型組Beclin-1表達增加(P＜0.05)，電針組Beclin-1表達比模型組增加(P＜0.05)。見表4。

表4 各組Beclin-1表達(%)

3 討論

本研究顯示，電針可改善MCAO大鼠學習記憶能力，改善腦缺血再灌注后病理損傷，同時伴有Beclin-1表達升高。

Beclin-1位于17q21，有12個外顯子，編碼蛋白相對分子質量60,000，由450個氨基酸序列構成[11]。Beclin-1也稱BECN1，是酵母ATG6的同系物，是自噬體形成過程中必需分子，在自噬過程中Beclin-1的表達上升[12-13]。作為自噬的直接執行者，Beclin-1蛋白除了接受自噬信號，還可接受其他信號，對自噬進行調節。Beclin-1已經成為衡量自噬發生程度的檢測方法之一[14]。

自噬是細胞受刺激后，通過溶酶體途徑降解細胞內物質的統稱，是細胞自我消化的過程。自噬也是近年來逐漸被認識的細胞除壞死和凋亡外第3種死亡方式[15-16]。作為一種程序化的細胞內降解機制，自噬的生理和病理作用非常廣泛，涉及癌癥、神經退行性病變、代謝性疾病、衰老以及免疫系統疾病[17-19]。Beclin-1能介導自噬蛋白定位于吞噬泡，調控哺乳動物自噬體的形成與成熟[20]。在生理條件下，自噬處于低水平，主要清除細胞內被降解的蛋白；在缺血再灌注等因素刺激下，細胞啟動自噬機制清除損傷線粒體，同時提高細胞對低氧的耐受力，對細胞起一定保護作用[21]。腦缺血后，大量活性氧、自由基釋放引起氧化應激，上調微管相關蛋白1輕鏈3、Beclin-1表達，從而誘導細胞自噬[22]。較早的研究顯示，腦缺血缺氧后，自噬可降解損傷的細胞器以避免凋亡，繼而產生能量以避免離子失衡和細胞壞死[8]。但之后的一些研究表明，自噬在缺血性腦損傷過程中會產生復雜的影響，甚至產生負面作用，即自噬在缺血性腦損傷中有可能發揮雙刃劍作用[23]。在輕度饑餓、缺氧等情況下，自噬不僅通過降解蛋白提供能量，且通過降解損傷蛋白合成新的蛋白，從而保護機體細胞[24]。若重度饑餓、缺氧，或延長細胞損傷時間，激活凋亡相關調控蛋白產生凋亡后，自噬也過度激活；過度激活的自噬又進一步促進凋亡發生，從而對機體產生損傷作用[25]。

中醫認為，督脈是人體諸陽之匯，有“總督諸陽”和“陽脈之海”之說。“病變在腦，首取督脈”，為治療腦部疾病首選。神庭、百會是督脈穴位，與腦密切聯系，是調節大腦功能的要穴。電針神庭、百會改善腦卒中后認知功能的作用在前期臨床及基礎實驗中均已證實[3,10,26]。在研究顯示，電針上調Beclin-1表達，從而誘發自噬，伴隨認知功能和病理損傷的改善，提示Beclin-1得到適度表達，起到神經保護作用。

綜上所述，電針神庭、百會穴可治療MACO大鼠學習記憶障礙，這種治療作用可能與上調自噬相關基因Beclin-1從而啟動自噬系統網絡有關。要精確調控自噬，為臨床治療提供新的治療靶點，需要更清楚地了解自噬調控通路的每一個環節。這仍有待進一步深入。本研究只檢測了與自噬相關的一種基因，存在一定局限性，有待今后研究繼續改善。

[1]曲艷吉,卓琳,詹思延.中國腦卒中后認知障礙流行病學特征的系統評價[J].中華老年心腦血管病雜志,2013,14(12):1294-1301.

[2]Park JH,Kim BJ,Bae H,et al.Impact of post-stroke cognitive impairment with no dementia on health-related quality of life[J].JStroke,2013,15(1):49-56.

[3]馮曉東,劉嬌,陳立典.電針對局灶性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及其機制[J].中國康復理論與實踐,2013,19(3):227-230.

[4]Marcucci F,Bellone M,Caserta CA,et al.Pushing tumor cells towards a malignant phenotype:Stimulifrom the microenvironment,intercellular communications and alternative roads[J].Int JCancer,2014,135(6):1265-1276.

[5]Wang P,Xue Y,Wei K,et al.ARRB1/β-arrestin-1 mediates neuroprotection through coordination of BECN1-dependent autophagy in cerebral ischemia[J].Autophagy,2014,10(9):1535-1548.

[6]王燕梅.自噬參與低氧后處理對成年大鼠短暫全腦缺血的保護作用[D].廣州:廣州醫學院,2012.

[7]丁培炎,王冬,赫曼,等.短期禁食誘導自噬對大鼠腦缺血損傷的保護作用[J].中華神經外科疾病研究雜志,2013,12(3):201-204.

[8]Gabryel B,Kost A,Kasprowska D.Neuronal autophagy in cerebral ischemia－a potential target for neuroprotective strategies?[J].Pharmacol Rep,2012,64(1):1-15.

[9]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[10]Feng XD,Yang S,Liu J,et al.Electroacupuncture ameliorates cognitive impairment through inhibition of NF-κB-mediated neuronal cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injured rats[J].Mol Med Rep,2013,7(5):1516-1522.

[11]Liang XH,Jackson S,Seaman M,et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature,1999,402(6762):672-676.

[12]Vanderlaag K,Su Y,Frankel AE,et al.1,1-Bis(3'-indolyl)-1-(p-substituted phenyl)methanes induce autophagic cell death in estrogen receptor negative breast cancer[J].BMC Cancer,2010,10:669.

[13]黃鳳媛,李菲,黃貴華,等.自噬基因Beclin1啟動子細胞自噬模型的建立[J].廣州中醫藥大學學報,2015,32(2):325-329.

[14]梁巧青,馮震博.自噬基因Beclin1的研究現狀[J].當代醫學,2010,16(9):21-22.

[15]Xu F,Gu JH,Qin ZH.Neuronal autophagy in cerebral ischemia[J].Neurosci Bull,2012,28(5):658-666.

[16]付俊,尚海旭,賈弘禔,等.Beclin1與自噬及腫瘤的關系[J].生理科學進展,2012,43(2):155-158.

[17]楊揚,趙美,趙銘,等.細胞自噬與心血管疾病中炎癥反應的相關性[J].心臟雜志,2015,27(3):340-343.

[18]陳曉龍,張明亮,余祖江,等.細胞自噬在肝臟疾病中作用機制的研究進展[J].河南醫學研究,2015,24(4):70-72.

[19]Ding ZB,Shi YH,Zhou J,et al.Association of autophagy defect with a malignant phenotype and poor prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2008,68(22):9167-9175.

[20]王遠航,夏盛源,王芳,等.自噬通路中mTOR、Beclin1與腫瘤關系研究的最新進展[J].基因組學與應用生物學,2015,34(8):1656-1662.

[21]馮曉東,王慧靈,陳卓,等.自噬在腦卒中后認知障礙中的作用研究[J].時珍國醫國藥,2017,28(7):1730-1732.

[22]Qin L,Wang Z,Tao L,et al.ER stress negatively regulates AKT/TSC/mTOR pathway to enhance autophagy[J].Autophagy,2010,6(2):239-247.

[23]胡偉,彭亞文,蔣帥,等.自噬在缺血性腦損傷中的作用研究進展[J].中華神經醫學雜志,2015,5(14):529-531.

[24]Nishida K,Kyoi S,Yamaguchi O,et al.The role of autophagy in theheart[J].Cell Death Differ,2009,16(1):31-38.

[25]Lipton P.Ischemic cell death in brain neurons[J].Physiol Rev,1999,79(4):1431-1568.

[26]劉嬌,馮曉東.電針百會、神庭穴配合康復訓練治療腦卒中后認知障礙臨床研究[J].中醫學報,2013,28(4):608-610.