電針預處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響①

葉濤，朱路文，唐強，李宏玉，吳孝軍，陳晨，姜云飛，李佳帥

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱市150001

全球每年約有1500萬人患有腦卒中，約有500萬人死亡，是造成死亡的第二大病因，也是長期殘疾的主要原因，其中缺血性腦卒中約占所有病例的80%[1]。目前臨床上急性缺血性腦卒中的標準治療是采用組織纖溶酶原激活物進行溶栓誘導再灌注，但由于其時間窗非常窄，極易造成腦缺血再灌注損傷的發生[2]。研究顯示[3-5]，細胞凋亡在腦缺血再灌注引起的二次損傷中發揮重要作用，與腦梗死體積的大小密切相關，p53、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X Protein,Bax)是調控細胞凋亡的關鍵靶點。電針預處理，即缺血前給予單次或重復多次的電針干預，可以誘導腦缺血耐受，減輕缺血再灌注后腦損傷程度，發揮腦保護作用[6]。與其他預處理方式比較，電針更加簡便易行，臨床可操作性強。我們前期研究顯示[6-7]，針刺時程是電針預處理腦保護作用強弱的關鍵因素之一，電針多次重復預處理誘導腦缺血耐受的效果優于單次預處理，且重復預處理時間越長效果越好。

為了更好貼合臨床住院治療時間，建立缺血性腦卒中二級預防的電針預處理方案，我們選擇每周5～6 d，連續2周的治療方案，其腦保護作用在多次基礎實驗中得到證實[8-10]。本研究觀察其對腦缺血再灌注大鼠腦缺血半暗區細胞凋亡及凋亡相關蛋白p53、Bax、Bcl-2表達的作用，擬從抗凋亡角度，探討電針預處理的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級Sprague-Dawley大鼠，雄性，8～10周齡，初始體質量220～240 g，購于遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK(遼)2015-0001。大鼠飼養于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心SPF級屏障系統，動物自由食水。溫度23～25℃，濕度60%～70%，人工光照12 h∶12 h明暗交替。

本實驗經黑龍江中醫藥大學動物實驗管理委員會批準，實驗大鼠的處置符合2006年科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

根據實驗室目前大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型成功率(80%以上)和術后1 d死亡率(10%左右)，考慮本實驗每組最終需要18只大鼠，規定本實驗的樣本量為72只。將72只大鼠編號，選擇數字表中的最大數對應大鼠編號1，依次從左至右，分別對應1～72號大鼠。用隨機數字除以3得余數0、1、2，余數為0的對應假手術組，余數為1對應模型組，余數為2對應電針預處理組，最終各組分得24只大鼠。取材時假手術組無淘汰，模型組因造模失敗與評分不合格各淘汰1只，電針預處理組因評分不合格淘汰2只，最終各組隨機取18只，多余大鼠用于其他研究。

1.2 實驗設備和試劑

G6805-2A型低頻脈沖電針儀：上海華誼公司。一次性無菌針灸針：北京漢醫醫療器械中心。Multiskan FC型酶標儀、微量移液器：美國THERMOSCIENTIFIC公司。RM2235型切片機：德國LEICA公司。H-2050R超速冷凍離心機：湖南湘儀公司。WD-9405B型水平搖床、DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀、DYCZ-40D型轉移槽：北京六一生物科技有限公司。

p53、Bax、Bcl-2、內參抗體 β-actin、羊抗兔IgG-HRP、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光液：沈陽WANLEIBIO公司。TEMED：美國AMRESCO公司。PVDF膜：美國MILLIPORE公司。預染蛋白Marker：加拿大FERMENTAS公司。TTC粉：北京索萊寶科技有限公司。TUNEL試劑盒：德國ROCHE公司。

1.3 模型建立

大鼠術前12 h禁食不禁水。2%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔注射麻醉后，參照改良Longa法制備大鼠MCAO再灌注模型。頸部正中切口，于右側胸鎖乳突肌與二腹肌前頭之間暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。結扎頸總動脈、頸外動脈，暫時夾閉頸內動脈，用7號針頭在頸總動脈距血管分叉1 cm處刺一小口，將用石蠟包被過頭端的魚線(直徑0.26 mm)經頸總動脈送入頸內動脈，插入深度約18～22 mm，直達大腦中動脈起始處。2 h后拔出栓線。再灌注2 h后行大鼠行為學評分，Longa評分2～3分的納入研究。

假手術組大鼠僅接受類似模型組的各項手術操作，不插入線栓。

1.4 電針預處理[9]

造模前2周，電針預處理組每次電針前腹腔注射2%戊巴比妥鈉3 ml/kg麻醉大鼠，恒溫加熱板維持體溫37～39℃。參照《實驗針灸學》定位百會穴，采用直徑0.25 mm，長25 mm針灸針向鼻尖方向平刺約5 mm。接G6805-2A型電針儀，正負極分別接大鼠右耳根部和針柄，疏密波，頻率2/15 Hz，強度以右耳出現輕微震顫為度，持續刺激30 min。電針間隔24 h，每6天休息1 d。共2周。

假手術組、模型組接受相同的麻醉操作，但不進行電針干預。

整個預處理過程保證周圍環境安靜，電針結束后放回籠待其自行蘇醒。

1.5 改良神經損害嚴重程度評分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)[11]

再灌注24 h后，各組大鼠行mNSS評分，分別從運動、感覺、反射三個方面對大鼠的神經功能缺損程度進行評估?？偡?4分，1～4分為輕度缺損，5～9分為中度缺損，10～14分為重度缺損。

1.6 取材

完成mNSS評分后，大鼠2%戊巴比妥鈉4～5 ml/kg腹腔注射深度麻醉。取6只斷頭取腦行TTC染色；6只用生理鹽水和4%多聚甲醛溶液心內灌注后，切取缺血半暗區組織，常規制備厚5μm石蠟薄片，行TUNEL染色；6只冰板上快速斷頭取腦，切取缺血半暗區組織，液氮凍存，待Western blotting檢測。

1.7 觀察指標

1.7.1 腦梗死體積[12]

腦組織置-20℃冰箱內速凍15～20 min后取出。間隔2 mm冠狀連續切取6個腦片，2%TTC PBS溶液37℃孵育15～20 min。平攤腦片于黑色背景上，旁邊放置一把卡尺，數碼相機拍照。Image-Pro Plus 6.0計算腦片的梗死面積與全腦面積百分比，取均數。

1.7.2 凋亡細胞計數

石蠟切片60℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟兩次，每次15 min，下行乙醇溶液水合，室溫下蛋白酶K消化30 min，PBS漂洗3次，每次5 min(下同)，37℃暗濕盒中滴加TUNEL反應液50μl孵育1 h，PBS漂洗；37℃暗濕盒中滴加POD反應液50μl孵育30 min，PBS漂洗。室溫下DAB顯色，PBS漂洗，蘇木素復染，溫水返藍。上行乙醇溶液脫水，二甲苯透明，封片。每只大鼠選1張切片，10×10倍鏡下定位腦梗死灶周邊區頂葉皮質陽性表達“熱點區”，10×40倍鏡下觀察不重疊3個視野并拍照。采用Image Pro Plus 6.0進行陽性細胞計數，取3個視野下的均值。

1.7.3 Western blotting

取腦組織樣本稱重，按加入蛋白裂解液5 ml/g制成蛋白勻漿，低溫孵育后收集上清。BCA法測定總蛋白濃度。上樣體積20μl，含蛋白40μg。SDS-PAGE電泳80 V、2.5 h分離目的蛋白，80V、1.5 h轉到PVDF膜。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入p53(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)一抗，4 ℃孵育過夜。搖床搖動TBST洗膜4次，每次5 min；加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃孵育45 min。搖床搖動TBST洗膜6次，每次5 min。加入ECL底物發光液，室溫靜置5 min，保鮮膜覆蓋，玻棒去除多余水分，暗室曝光顯影。掃描后，采用Quantity One圖像分析軟件進行定量分析。以假手術組某一樣本蛋白表達量為1，其余樣本均為與其較正后的相對表達量。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0進行統計分析。數據以(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 mNSS

假手術組大鼠mNSS評分均為0。模型組mNSS評分較假手術組升高(P＜0.05)，電針預處理組mNSS評分較模型組降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 凋亡細胞計數

假手術組大鼠TUNEL陽性細胞極少。模型組TUNEL陽性細胞較假手術組增多(P＜0.05)，電針預處理組TUNEL陽性細胞較模型組減少(P＜0.05)。見表2、圖1。

2.3 Western blotting

假手術組p53、Bax、Bcl-2蛋白基礎表達。與假手術組比較，模型組p53、Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白降低，Bax/Bcl-2比升高(均P＜0.05)；與模型組比較，電針預處理組p53、Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，Bax/Bcl-2比降低(P＜0.05)。見表2、圖2。

2.4 腦梗死體積

假手術組未出現腦梗死。模型組腦梗死百分比較假手術組增加(P＜0.05)，電針預處理組腦梗死百分比較模型組減小(P＜0.05)。見表2、圖3。

表1 各組大鼠mNSS評分比較

表2 各組大鼠各檢測指標比較

圖1 各組TUNEL陽性細胞(TUNEL染色，bar=50μm)

圖2 各組Western blotting檢測結果

圖3 各組大鼠腦梗死體積(TTC染色)

3 討論

缺血性腦卒中屬于中醫學“中風”范疇，多因風、火、痰、瘀等病邪上擾清竅，而致“竅閉神匿，神不導氣”所致，治療當遵循“病變在腦，首取督脈”的理論。百會穴屬督脈，為百脈之會，百病所主，有通絡理氣、升陽益氣、熄風開竅、醒腦利竅等功效[13]。國內外研究證實[7-8,10,14-19]，重復電針預處理百會穴可誘導腦缺血耐受，降低腦缺血再灌注損傷程度，發揮腦保護作用，機制與降低炎性反應、細胞凋亡、氧化應激、內質網應激，增強細胞自噬，促進細胞存活與增殖等有關，涉及多水平、多通路、多靶點的復雜調控網絡。

細胞凋亡是多基因調控的細胞程序性死亡，再灌注引起的遲發型神經細胞死亡多以細胞凋亡為主，主要發生在缺血中心區周圍的半暗區，腦損傷的嚴重程度、腦梗死體積的大小與其密切相關[20]。如何精準調控細胞凋亡，挽救缺血半暗區細胞成為減輕腦缺血損傷程度的重要靶點。本研究顯示，腦缺血再灌注后，缺血半暗區大量神經細胞發生細胞凋亡；電針預處理干預可降低細胞凋亡水平，縮小腦梗死體積，改善神經功能，發揮腦保護作用。

本課題組前期已經證實[8-9,12]，電針預處理的抗凋亡作用與下調缺血半暗區Toll樣受體-4、核轉錄因子-κB蛋白表達，抑制血清與腦組織中白介素-1β、白介素-6介導的炎性損傷有關，但其具體機制仍需進一步闡明。

腫瘤抑制基因p53是細胞生存和死亡的重要調制器，抑制其表達可作為缺血性腦卒中的治療手段[3,21]。p53作為調控細胞凋亡的關鍵基因，通過調控其下游相關通路靶蛋白發揮促進細胞凋亡功能。正常組織中表達量極低，主要通過轉錄依賴機制及轉錄非依賴機制兩種途徑引發細胞凋亡。除促進細胞凋亡外，p53還具有調控細胞增殖、自噬、再生修復、細胞生長分化等作用[22-24]。

Bcl-2家族主要參與細胞內源性凋亡途徑，其作用貫穿腦缺血再灌注損傷始終[25]。Bcl-2是Bcl-2家族成員之一，是公認的抑制細胞凋亡基因，能夠抑制細胞凋亡但不影響細胞增殖。Bcl-2是一種與線粒體相關的膜穩定蛋白，能夠維持和保護膜的穩定性，抑制自由基產生，維持細胞核內鈣離子濃度，抑制caspase活化和與Bax形成異源二聚體等，抑制細胞凋亡早期階段[26-27]。腦缺血可促進p53表達，p53能抑制Bcl-2表達，同時促進Bax表達，上調Bax/Bcl-2比，進而調控caspase促進細胞凋亡，加重腦損傷[28-30]。電針干預可下調大腦皮層、海馬Bax/Bcl-2比，使抗凋亡基因占據優勢，抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡，減輕腦水腫，改善神經功能缺損[20,31]。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后缺血半暗區p53、Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調，與既往結果保持一致。電針預處理一方面可以抑制促凋亡基因p53、Bax表達上調，另一方面又可促進抗凋亡基因Bcl-2進一步表達，下調Bax/Bcl-2比，從而降低細胞凋亡水平，發揮腦保護作用。

本研究尚不能證明電針預處理抑制p53表達與下調Bax/Bcl-2比直接相關，且僅從抗凋亡角度探討了p53在電針預處理誘導腦缺血耐受中的作用機制。下一步我們將應用p53抑制劑和激動劑對p53介導的凋亡、自噬、細胞增殖途徑展開深入研究，并探討電針預處理在其中所發揮的作用，豐富其腦保護作用機制。

近年來，多項電針預處理的臨床應用研究證實，其在心、腦損傷方面具有保護作用，有很好的臨床應用前景[32-34]。我們將設計缺血性腦卒中電針預處理方案，以降低再次卒中的發病率和致殘率。

[1]Murray CJ,Lopez AD.Measuring the global burden of disease[J].N Engl JMed,2013,369(5):448-457.

[2]Ansar S,Chatzikonstantinou E,Thiagarajah R,et al.Pro-inflammatory mediators and apoptosis correlate to rt-PA response in a novel mouse model of thromboembolic stroke[J].PLoS One,2014,9(1):e85849.

[3]Kizmazoglu C,Aydin HE,Sevin IE,et al.Neuroprotective effect of resveratrol on acute brain ischemia reperfusion injury by measuring annexin V,p53,Bcl-2 levels in rats[J].JKorean Neurosurg Soc,2015,58(6):508-512.

[4]Zhang J,Xia Y,Xu Z,et al.Propofol suppressed hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in HBVSMC by regulation of the expression of Bcl-2,Bax,Caspase3,Kir6.1,and p-JNK[J].Oxid Med Cell Longev,2016,2016:1518738.

[5]Lu H,Wang B.SIRT1 exerts neuroprotective effects by attenuating cerebral ischemia/reperfusion-induced injury via targeting p53/microRNA-22[J].Int J Mol Med,2017,39(1):208-216.

[6]葉濤,朱路文,唐強.電針預處理誘導腦缺血耐受的研究進展[J].針灸臨床雜志,2015,31(2):87-90.

[7]林咸明,陳麗萍,姚旭.不同時程電針預處理對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障基質金屬蛋白酶-9,血管內皮生長因子的影響[J].針刺研究,2015,40(1):40-44.

[8]朱路文,葉濤,姜云飛,等.電針預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后炎性因子及細胞凋亡的影響[J].中國康復理論與實踐,2016,22(7):765-768.

[9]葉濤,朱路文,唐強,等.電針預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能和缺血半暗區Tolls樣受體4、核轉錄因子κB蛋白的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(7):745-749.

[10]葉濤,朱路文,唐強,等.電針預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積及血清TNF-α、IL-10含量的影響[J].中國針灸,2017,37(10):1093-1098.

[11]唐強,葉濤,朱路文,等.針康法對腦缺血大鼠神經功能和細胞外信號調節激酶1/2信號通路的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(1):27-31.

[12]Zhu L,Ye T,Tang Q,et al.Exercise preconditioning regulates the Toll-like receptor 4/nuclear factor-κb signaling pathway and reduces cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury:a study in rats[J].JStroke Cerebrovasc Dis,2016,25(11):2770-2779.

[13]程為平,韋燕博,張茜茹.論百會穴穴性及臨床應用[J].遼寧中醫藥大學學報,2015,17(3):5-6.

[14]He X,Mo Y,Geng W,et al.Role of Wnt/β-catenin in the tolerance to focal cerebral ischemia induced by electroacupuncture pretreatment[J].Neurochem Int,2016,97:124-132.

[15]Jung YS,Lee SW,Park JH,et al.Electroacupuncture preconditioning reduces ROSgeneration with NOX4 down-regulation and ameliorates blood-brain barrier disruption after ischemic stroke[J].JBiomed Sci,2016,23:32.

[16]Ran QQ,Chen HL,Liu YL,et al.Electroacupuncture preconditioning attenuates ischemic brain injury by activation of the adenosine monophosphate-activated protein kinase signaling pathway[J].Neural Regen Res,2015,10(7):1069-1075.

[17]Wu ZQ,Cui S,Zhu L,et al.Study on the mechanism of mTOR-mediated autophagy during electroacupuncture pretreatment against cerebral ischemic injury[J].Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016:9121597.

[18]陳懷龍,齊慧,劉孝潔,等.電針預處理對全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬葡萄糖調節蛋白78和生長停滯及DNA損傷基因153表達的影響[J].針刺研究,2014,39(6):431-436.

[19]張業貴,龔鑫,侯良芹.電針預處理對腦缺血再灌注大鼠大腦皮質一氧化氮合酶及膠質纖維酸性蛋白表達的影響[J].針刺研究,2015,40(2):113-118.

[20]張業貴,龔鑫,李懷斌.電針對腦缺血再灌注大鼠額葉皮質和海馬CA1區Bcl-2,Bax表達的影響[J].皖南醫學院學報,2014,33(2):95-98.

[21]Balaganapathy P,Baik SH,Mallilankaraman K,et al.Interplay between Notch and p53 promotes neuronal cell death in ischemic stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab,2017.[Epub ahead of print].doi:10.1177/0271678X17715956.

[22]范瑞娟,羅亞非,陳永順,等.桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦皮質神經元Caspase-3與p53表達的影響[J].神經解剖學雜志,2015,31(6):739-745.

[23]Li T,Liu X,Jiang L,et al.Loss of p53-mediated cell-cycle arrest,senescence and apoptosis promotes genomic instability and premature aging[J].Oncotarget,2016,7(11):11838-11849.[24]Zhang P,Lei X,Sun Y,et al.Regenerative repair of Pifithrin-α in cerebral ischemia via VEGF dependent manner[J].Sci Rep,2016,6:26295.

[25]沈梅紅,劉曉華,李纓,等.電針調節腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Bcl-2和Bax mRNA的表達[J].遼寧中醫雜志,2012,39(1):155-157.

[26]卜淵,張培影,耿德勤,等.電針藥氧對大鼠全腦缺血再灌注后Bcl-2、Bax蛋白表達的影響[J].針刺研究,2010,35(3):208-212.

[27]陳鋒,嚴志康,楊波.頭皮針對腦缺血再灌注大鼠缺血區腦組織bcl-2、caspase-3蛋白表達以及血液流變的影響[J].針刺研究,2009,34(6):363-367.

[28]顏玲,黃德彬,劉錦紅,等.黃芪多糖對腦缺血再灌注大鼠腦皮質中HSP70、PKB和P53蛋白表達的影響[J].中國病理生理雜志,2012,28(9):1610-1617.

[29]吳孝軍,葉濤,李宏玉,等.運動預處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區細胞凋亡及相關蛋白P53表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2016,22(10):1117-1120.

[30]Liu QS,Deng R,Li S,et al.Ellagic acid protects against neuron damage in ischemic stroke through regulating the ratio of Bcl-2/Bax expression[J].Appl Physiol Nutr Metab,2017,42(8):855-860.

[31]范茜茜,董勤,沈梅紅,等.電針對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響[J].中國老年學,2017,37(5):1041-1043.

[32]Lu ZH,Bai XG,Xiong LZ,et al.Effect of electroacupuncture preconditioning on serum S100βand NSE in patients undergoing craniocerebral tumor resection[J].Chin J Integr Med,2010,16(3):229-233.

[33]Yang L,Yang J,Wang Q,et al.Cardioprotective effects of electroacupuncture pretreatment on patients undergoing heart valve replacement surgery:a randomized controlled trial[J].Ann Thorac Surg,2010,89(3):781-786.

[34]Wang Q,Liang D,Wang F,et al.Efficacy of electroacupuncture pretreatment for myocardial injury in patients undergoing percutaneous coronary intervention:a randomized clinical trial with a 2-year follow-up[J].Int JCardiol,2015,194:28-35.