大鼠脊髓損傷后神經連接蛋白1的表達①

郭永強，趙鑫，陳鐵戈，張東亮，王明，汪靜，李森，王海燕，伍亞民，張海鴻

1.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州市730030；3.陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所三室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042

脊髓損傷會引起肢體運動、軀體感覺以及內臟活動等一系列功能障礙，對患者家庭以及社會造成嚴重負擔[1]。促進脊髓損傷后突觸再生有助于提高機體相關功能恢復[2-3]，改善預后。

神經連接蛋白(neuroligins,NLs)家族作為突觸后一類細胞黏附分子，與突觸前軸突蛋白結合，形成跨突觸的復合結構[4-5]。NLs在神經系統發育早期具有調節突觸形成的作用[6]，后期則主要影響神經元興奮性[7]。NL1是目前研究最為清楚的NLs家族成員。研究發現，除參與形成興奮性突觸后結構外，NL1還與突觸發生形成以及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體形成有關[8-12]。NL1既是形成突觸的結構蛋白，也是影響突觸發生形成以及信息傳遞的功能蛋白。

本實驗研究動態檢測大鼠脊髓損傷后NL1表達的變化，為進一步研究脊髓損傷后突觸再生及其相關影響因素提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級成年雌性Sprague-Dawley大鼠60只，體質量(200±10)g，由陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所動物中心提供。采用隨機數字法，將動物編號后等分為假手術組和實驗組，再用隨機數字法將兩組大鼠按照術后時間等分為3 d、7 d、14 d、21 d和28 d五個亞組。實驗大鼠依照實驗動物相關福利與倫理原則進行處理。

1.2 主要試劑和儀器

NL1抗體(H-45,OM160293)：OMNIMABS公司。Alexa Flour 647標記山羊抗兔(H+L,A0468)：碧云天生物技術有限公司。FD快速Golgi-Cox染色試劑盒：美國NEUROTECHNOLOGIES公司。OCT冰凍切片包埋劑：美國SAKURA公司。Triton X-100、DAPI和Tween 20：SIGMA公司。RM2007 Allen打擊器：美國新澤西州大學。冰凍切片機和SP-2激光共聚焦顯微鏡：德國LEICA公司。

1.3 模型制作

動物常規術前準備。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，待大鼠角膜反射消失后，背部剃毛備皮，俯臥位固定于鼠板上。定位標記T10(兩耳尖連線向尾端三橫指處)，碘伏棉球擦拭消毒備皮術區。以T10標記為中心，做長約3 cm縱形切口，逐層分離皮下筋膜及肌肉組織，暴露并切除T9-11椎板，充分顯露T10節段脊髓。操作過程中不能損傷脊髓并保證硬脊膜完整。

將實驗組大鼠固定到Allen打擊器上，調節打擊棒末端以對準T10節段脊髓，打擊力度設置為10 g×25 mm，按打擊按鈕完成脊髓打擊。打擊成功的標志為大鼠雙下肢痙攣性抽搐，尾巴翹起擺動后倒下，被打擊部位脊髓立即出現充血水腫。

兩組大鼠均以無菌生理鹽水沖洗手術切口，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，碘伏棉球擦拭消毒手術切口。術后腹腔注射青霉素每天16萬U，共3 d。恢復自主排尿前，每天按壓膀胱協助排尿，早中晚各一次。

1.4 后肢運動功能評分

分別于各時間點，由2名以上熟悉BBB評分方法的非本實驗組人員，對大鼠行BBB評分。大鼠放入曠場讓其爬行，觀察髖、膝和踝關節的運動情況，以及軀體運動的協調情況。實驗組大鼠如術后1 d和3 d評分偏離平均值≥2分者予以剔除，及時造模補缺。

1.5 Golgi-Cox染色

取材前1 d將A、B液等體積混合并避光保存。每組取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后活取脊髓，雙蒸水漂洗后浸入A、B混合液中，24 h后換液，室溫下避光放置2周。將組織轉移至C液中，次日換液，4℃避光放置72 h。吸水紙吸干組織表面液體，少量OCT包埋劑包埋后，置-80℃冰箱中速凍。冰凍切片機縱切片，厚60μm。組織切片貼在涂有C液、經明膠包被的載玻片上。避光風干24 h后雙蒸水沖洗兩次，每次4 min。將切片浸入D液、E液和雙蒸水比例為1∶1∶2的混合液中10 min；再依次浸入50%、75%和95%乙醇中脫水，每個梯度4 min；無水乙醇中脫水4次，每次4 min。二甲苯透明3次，每次4 min，高濃度樹脂封片劑封片。10×40倍鏡下觀察脊髓損傷中心上端白質中樹突，10×100倍油鏡下計數10μm長度內樹突棘數。

1.6 免疫熒光染色

每組取3只大鼠，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，分別用0.01 mol/L PBS 200 ml和4%多聚甲醛溶液200 ml經左心室灌注固定。以脊髓損傷部位為中心，遠端和近端各延長5 mm截取脊髓，浸入4%多聚甲醛溶液4℃冰箱固定24 h后，轉移含30%蔗糖0.01 mol/L PBS中脫水，待沉底后取出。OCT包埋劑包埋后，置-80℃冰箱速凍。冰凍切片機連續切片，厚20μm。貼片后室溫自然風干30 min，置-20℃冰箱中備用。

切片室溫復溫30 min，0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；0.3%Triton X-100破膜30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；5%正常山羊封閉血清封閉20 min；吸棄封閉液，吸水紙吸干，滴加NL1一抗(1∶20)，4℃冰箱孵育過夜；室溫復溫，吸棄一抗，含0.2%Tween 20的0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；吸水紙吸干；滴加Alexa Fluor 647熒光標記山羊抗兔二抗(1∶500)，37℃避光孵育1 h；吸棄二抗，含0.2%Tween 20的0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；滴加DAPI(10 mg/L)，常溫避光反應3 min。吸棄DAPI，吸水紙吸干，抗熒光淬滅劑封片。選擇實驗組各時間點損傷區域上段位置相對統一且組織結構完整的切片，同時選擇假手術組相同脊髓節段切片，激光共聚焦顯微鏡200倍下掃描成像，拍照。Image J1.50i軟件計算平均光密度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。結果均用(xˉ±s)表示，假手術組與實驗組比較均采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 后肢運動功能評分

實驗組術后3 d雙后肢基本無自主活動；術后7 d髖、膝關節活動有所恢復，踝關節及趾跖關節均無活動；術后14 d髖關節已能廣泛活動，膝、踝關節輕微或廣泛活動；術后21 d髖、膝及踝關節已能廣泛活動，同時伴有爪背面支撐移動或爪掌面著地；術后28 d除髖、膝、踝關節自主廣泛活動外，已普遍可以用爪掌面承重移動，但與前肢活動的協調性較差，且軀干明顯不穩。

假手術組術后各時間點髖、膝、踝及趾跖關節活動均正常。術后3 d部分大鼠有活動時軀干不穩現象，但術后7 d基本恢復正常。

術后各時間點，實驗組BBB評分均顯著低于假手術組(P＜0.001)。見圖1。

圖1 各組大鼠BBB評分比較

2.2 Golgi-Cox染色

400倍光鏡下，各組損傷區上段結構完整，大致同一區域白質中樹突變化見圖2。與假手術組相比，實驗組術后3 d及7 d樹突減少不明顯，術后14 d、21 d和28 d樹突逐漸稀疏。

1000倍油鏡下各組樹突棘變化見圖3。與假手術組相比，脊髓損傷后樹突棘密度隨時間進展逐漸降低(圖 4)。

2.3 免疫熒光染色

與假手術組相比，實驗組術后3 d NL1熒光信號開始增強，至術后14 d時最強；隨后逐漸減弱；術后28 d時仍高于假手術組(圖5、圖6)。

圖2 假手術組及實驗各組樹突形態(Golgi-Cox染色,bar=20μm)

圖3 假手術組及實驗各組樹突棘形態(Golgi-Cox染色,1000×)

圖4 各組大鼠樹突棘密度比較

圖5 各組大鼠NL1免疫熒光平均光密度比較

圖6 假手術組及實驗各組NL1表達(免疫熒光染色,200×)

3 討論

脊髓損傷后突觸再生與重塑有助于神經功能恢復。突觸形成是一個包括多步驟的復雜過程，存在很多影響因素[13-14]。由于神經系統再生能力差，且損傷后大量星形膠質細胞被激活導致膠質瘢痕增生，以及小膠質細胞和巨噬細胞激活引發神經炎癥反應，使脊髓損傷后突觸再生受到限制[15-17]。脊髓損傷后，由于血-脊髓屏障被破壞，大量血管活性肽、細胞因子以及炎癥細胞進入脊髓組織[18]，進入組織的炎癥趨化因子可以通過與其受體結合，影響突觸形成[2]。NL1作為形成興奮性突觸的結構蛋白和功能蛋白，在突觸形成和發生過程中發揮重要作用。

NL1是由神經元合成的突觸后跨膜蛋白，在細胞內與興奮性突觸后膜上的突觸后致密蛋白質95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)通過-C端PDZ結構域結合序列相結合[19]，且與橋尾蛋白通過胞內結構域中部的一致性序列相結合[20]；同時NL1與突觸前軸突蛋白-1β通過細胞外結構域相連接[21]。NL1與軸突蛋白-1β在突觸發生和成熟過程中發揮重要作用[22]。既往研究表明[9-12]，NL1在神經元中過表達，可促進突觸生成；NL1被沉默時，突觸數量減少。

樹突棘作為構成突觸后成分的特異性結構，其密度和結構改變可間接反映脊髓損傷后突觸修復情況[23]。本研究顯示，脊髓損傷后，樹突和樹突棘密度呈持續下降趨勢，而NL1的表達則呈先增高后降低的趨勢。由于NL1由神經元合成，而脊髓損傷后有大量神經元壞死和凋亡，導致樹突和樹突棘密度降低；而在損傷后28 d內，NL1的表達都高于假手術組，NL1表達的升高并未與樹突及樹突棘密度的變化趨勢一致，提示NL1并未對突觸再生發生影響。另一方面，由于NL1是一種結構和功能蛋白分子，即使NL1參與脊髓損傷后突觸再生，樹突棘密度在短期內的變化并不能充分反映突觸再生情況。脊髓損傷后NL1對于突觸再生的影響還需進一步研究。

Xu等[24]發現，NL1是血小板反應蛋白-1促進突觸生成的效應分子；而血小板反應蛋白-1在小鼠大腦損傷后表達升高，且是損傷后神經功能恢復所必需[25]。本實驗發現NL1在大鼠脊髓損傷后28 d內表達都高于假手術組，但這一變化不足以引起損傷脊髓的突觸再生。其機制有待進一步研究。

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