沉默白細胞介素-1β基因對脊髓鈍挫傷大鼠波形蛋白的影響①

胡析，牛英杰，黃媛，李盈潔，曾茜，向陽，張曉，梁楠

1.成都醫學院，a.臨床醫學院；b.檢驗醫學院；c.基礎醫學院實驗教學中心，四川成都市610500

脊髓損傷是中樞神經系統常見的外傷，常由于車輛事故、高空墜落等造成，給患者、家庭和社會帶來巨大的心理壓力和沉重的經濟負擔[1-2]。脊髓初期機械性損傷導致脊髓缺血、缺氧、水腫、炎癥、脂質過氧化和自由基損傷等二次損傷，其中炎癥反應是導致神經損傷和功能喪失的重要原因[3-4]。

白細胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)是一種重要的炎性因子，可介導中性粒細胞浸潤，引起白細胞聚集，刺激白細胞、內皮細胞等表達黏附分子，進而導致過度的炎癥反應和脊髓缺血，還能促進自由基和興奮性氨基酸等神經毒性物質的產生和釋放[5-6]。IL-1β在脊髓損傷早期過量表達，參與急性脊髓損傷發生發展過程，加重炎癥反應，造成組織損傷，誘導神經細胞的凋亡[7-8]。

波形蛋白(vimentin,Vim)是目前已知表達最廣泛的Ⅲ型中間絲蛋白，與微管、微絲一起構成細胞骨架，與中樞神經系統的分化、發育以及損傷修復等生物學行為密切相關[9]。在脊髓損傷早期，炎癥反應刺激星形膠質細胞進入增殖狀態。星形膠質細胞腫脹、肥大，發生反應性膠質增生，與結締組織等形成膠質瘢痕[10]。在脊髓損傷早期，IL-1β作為炎癥因子不僅加重脊髓缺氧缺血區域的炎癥反應，還會導致神經膠質細胞增生。在脊髓損傷晚期，脊髓膠質瘢痕導致運動功能難以恢復[11]。波形蛋白不僅能維持細胞骨架穩定，還與損傷后膠質瘢痕形成和抑制軸突再生有關[12]。

本研究采用免疫組化技術以及實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)，對波形蛋白表達進行定位和定量研究。利用慢病毒干擾IL-1β基因表達，生物信息學方法預測IL-1β與波形蛋白的關系，了解脊髓損傷后干預IL-1β的表達對脊髓膠質瘢痕的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年Sprague-Dawley大鼠30只，3月齡，雌雄不限，體質量200～220 g，由四川省中醫藥科學院提供，許可證號SCXK(川)2013-19。分籠飼養，溫度20～25℃。大鼠編號，采用Excel生成隨機數，將大鼠分為空載組(n=15)和干擾組(n=15)，兩組再分為3 d、7 d和28 d三個亞組，3 d和28 d亞組各3只大鼠，7 d亞組9只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒質粒的制備

引物和質粒均購自GeneCopoeia。將IL-1βsiRNA序列克隆到紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)標記的載體中，將該載體5μg和慢病毒1μl包裝質粒，共轉染到293T細胞，生成慢病毒質粒。48 h后取含有慢病毒細胞的上清液，置于0.45μm醋酸纖維素過濾器中過濾，除去濾液，取5 ml，4℃、3500 r/min離心25 min，除去上清液，沉淀重新溶解在PBS 500 μl中。-80℃冰箱凍存。

1.2.2 載體注射

大鼠用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，雄性30 mg/kg，雌性20 mg/kg。俯臥位固定，常規備皮、消毒，背部T9-11水平正中切口，分離筋膜、肌肉，剝除T11棘突及椎板，充分暴露T10節段脊髓。使用DW-5腦立體定位儀(成都泰盟)于T10節段脊髓擬打擊點左右兩側各注射慢病毒質粒5μl(干擾組)或含有空載體的質粒5μl(空載組)，進針3～5μm，朝著大鼠尾側進針，與水平線呈45°。依次縫合肌肉、筋膜及皮膚，消毒及抗感染處理后獨籠飼養。

1.3 模型制備

大鼠在注射質粒48 h后，同法麻醉，常規消毒，拆線打開切口，采用Allen法以自行制作的打擊裝置，用10 g沖擊棒自30 mm高處自由墜落，致傷脊髓。逐層縫合傷口。

術后大鼠注射青霉素16萬U、5%葡萄糖氯化鈉溶液2 ml，小心護理，獨籠飼養。每天早晚擠壓大鼠膀胱協助排尿各2次，至排尿反射恢復。注意觀察皮膚有無壓瘡或感染、下肢有無潰爛。室溫維持25～30℃，正常飲食。

大鼠的模型操作和術后護理遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》、《實驗動物管理條例》、《醫學實驗動物管理實施細則》的規定。

1.4 免疫組化染色

各組術后3 d、7 d及28 d各取3只大鼠，同法麻醉，俯臥位固定，自左心室插管，剪開右心耳，快速灌注4℃生理鹽水，至肝臟變為黃褐色，再灌注4%多聚甲醛20 min。打開椎弓管，暴露并切除T8、T10、T12脊髓，固定48 h后放入自動脫水包埋機，常規制備石蠟切片，厚5μm，取連續5張貼片、烤片。

酶免疫組化染色采用SP法。烤片、脫蠟及水化，高壓熱抗原修復，3%H2O2封閉內源性過氧化酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。加波形蛋白一抗(1∶200，武漢博士德)4℃過夜；次日取出復溫，0.01 mol/L PBS漂洗，依次加入SP試劑(SP-9001，北京中杉金橋)B液與C液，37℃孵育，間隔使用PBS漂洗；配制DAB-H2O2顯色液，室溫下反應。顯微鏡下顯色充分，及時用0.01 mol/L PBS終止反應。蘇木素復染，1%鹽酸-酒精分色，自來水返藍，梯度灑精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。OLYMPUS光學顯微鏡400倍下觀察免疫陽性反應物分布情況。

1.5 RT-qPCR

術后7 d大鼠6只同法麻醉，以損傷段為中心，取出損傷段脊髓1 cm，-80℃冰箱保存。脊髓放入經過DEPC水處理過后的玻璃勻漿器中，經Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇處理，得到總RNA，去核酸水30μl溶解，保存于-80℃冰箱。取所得RNA經全波長酶標儀(Thermo,1510)測量OD值，檢測其純度合格后，按說明書進行逆轉錄合成cDNA(Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit，MBI公司)，然后進行引物擴增。擴增參數：95℃2 min，95℃15 s，52℃20 s，60 ℃ 40 s， 45個循環。讀取Ct，按2-ΔΔCt計算出相對含量。

引物如下：

IL-1β：正向 5'-GAG CTG AAA GCT CTC CAC C-3'；逆向 5'-TTCCATCTTCTTCTTTGGGT-3'。

波形蛋白：正向5'-CTC TGC CAC TCT TGC TCC TGG A-3'；逆向5'-AAA TAT CTG ACC AAC TTGTTA C-3'。

β-actin：正向 5'-GAA GAT CAA GAT CAT TGC T-3'；逆向 5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。

1.6 生物信息學分析

通過http://www.genemania.org/進行搜索。物種選擇H.sapiens(human)和R.norvegicus(rat)，目的基因選擇IL-1β和波形蛋白。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件處理數據。數據以(xˉ±s)表示，采用獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 生物信息學分析

2.1.1 人類基因

IL-1β與肌聯蛋白(Titin,TTN)存在共同表達關系，與IL-1受體1(IL1R1)位于同一信號通路，擁有相同的物理反應結構域。波形蛋白與IL1R1共表達，與TTN存在共同表達，并位于同一信號通路中。見圖1。

2.1.2 大鼠基因

波形蛋白與IL-18、CXC類趨化因子10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)、S100鈣結合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8,S100A8)、S100A9、受體相互作用蛋白激酶-3(receptor interacting serine/threonine kinase 3,RIPK3)、趨化因子C-C配體3(C-C motif chemokine ligand 3,CCL3)存在共同表達關系。波形蛋白與CXCL2和磷脂酶A2-ⅣA(Phospholipase A2 Group IVA,PLA2G4A)存在共同表達和共同的物理反應結構域的關系。IL-1β與S100A8、S100A9、CCL3、CXCL2、PLA2G4A、CXCL1、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)存在共同表達。IL-1β與IL18存在共同表達和共享蛋白結構域，與CXCL10和RIPK3存在共同表達和共同定位。見圖2。

2.2 免疫組化染色

波形蛋白存在于脊髓前角神經元和神經膠質細胞中。各時間點，干擾組免疫陽性細胞數均低于空載組(P＜0.05)。見表1、圖3。

圖1 人類基因中IL-1β與波形蛋白的預測關系

圖2 大鼠基因中IL-1β與波形蛋白的預測關系

表1 各時間點各組脊髓中波形蛋白陽性細胞數比較(/HD)

圖3 各時間點各組脊髓中波形蛋白表達(免疫組化染色，400×)

2.3 RT-qPCR

術后7 d，干擾組波形蛋白mRNA相對表達量(0.279±0.023)，較空載組(0.818±0.178)明顯下降(t=6.692,P=0.002)。

3 討論

脊髓損傷是一個破壞性嚴重且病理生理比較復雜的臨床疾病，能夠造成神經再生與功能恢復障礙，可導致運動、感覺和自主神經功能障礙。

本研究顯示，脊髓損傷后，大鼠神經功能改善有限，不足以引起運動功能有意義的改變；波形蛋白主要在脊髓前角神經元和神經膠質細胞中表達；抑制IL-1β表達后，波形蛋白表達明顯下降。

脊髓損傷的功能恢復與神經膠質細胞的功能密切相關。在中樞神經系統，神經膠質細胞分布廣泛，具有支架作用，支持神經元胞體和突起保持一定形態。神經膠質細胞在出生后仍然保持一定的分裂能力[13]。

脊髓損傷后限制神經再生的主要原因有膠質瘢痕形成、抑制性微環境(硫酸軟骨素蛋白聚糖和髓磷脂相關抑制因素)和神經營養支持的缺乏。其中膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、波形蛋白和巢蛋白等中間絲蛋白的沉積是主要因素，星形膠質細胞肥大為特征的反應性神經膠質增生[14]。

脊髓損傷后，星形膠質細胞活化與神經炎癥反應密切相關。在炎癥因子等環境條件因子的作用下，靜止的星形膠質細胞被激活，細胞體積肥大、數量增加，細胞間互相連接形成致密網狀結構，過度表達中間絲蛋白，如GFAP和波形蛋白[15-16]。

波形蛋白是哺乳動物中間絲蛋白的一種，表達于間充質細胞、軟骨細胞和內皮細胞，在反應型星形膠質細胞表達上調[17-18]。波形蛋白在形成膠質瘢痕并抑制軸突再生的過程中發揮重要作用[19-20]。

IL-1β是重要的炎癥因子，在脊髓損傷后早期大量釋放，造成脊髓二次損傷[21]。IL-1β主要來源于脊髓損傷局部的神經元和神經膠質細胞。在正常中樞神經系統中幾乎檢測不到IL-1β表達，但損傷后表達增加數倍[22]。宋興華等[23]研究發現，IL-1β在脊髓損傷后30 min表達快速增高，并于損傷后6 h達到高峰，此后逐漸下降。IL-1β參與合成損傷介質，促進機體炎癥反應，導致脊髓損傷局部炎癥和水腫[24]，引起脊髓組織潰變和壞死，進而形成脊髓空洞。此外，IL-1β還可能參與細胞凋亡過程[25]。Nesic等[26]研究表明，IL-1β受體拮抗劑可明顯減少脊髓損傷區細胞凋亡。

脊髓損傷后IL-1β對波形蛋白表達可能有影響。GeneMANIA生物信息學分析顯示，IL-1β與波形蛋白存在著多種直接或間接關系。IL-1β是一種重要的炎性介質，在正常脊髓組織中，IL-1βmRNA表達微弱，而在脊髓損傷后3 h表達迅速升高，并于12 h達到峰值；隨后表達逐漸降低[27]。脊髓損傷后，IL-1β可能參與誘導神經膠質細胞增生，促進波形蛋白表達和膠質瘢痕形成；抑制波形蛋白表達可減少瘢痕的形成，促進損傷部位軸突的延伸。

綜上所述，波形蛋白廣泛表達于神經膠質細胞，促進損傷后膠質瘢痕形成。通過調節炎癥因子IL-1β可以影響膠質細胞的增殖和脊髓瘢痕形成，進一步影響脊髓損傷后大鼠功能恢復，為將來臨床治療脊髓損傷提供了可能的治療新靶點。

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