黑木耳液體發酵菌種的制作技術要點

王慶武 喬愛麗 蘭玉菲

（泰安市農業科學研究院，山東泰安271000）

黑木耳（Auricularia auricular）是我國傳統食用菌[1]，因營養價值高，而受到消費者的青睞，栽培面積不斷擴大，生產水平穩步提高[2]。傳統的黑木耳栽培所用菌種為固體菌種，每級菌種代代轉接，生產周期長，菌齡不整齊[3]，污染率及成本高，生產效率低。而發酵菌種是用液體培養基，在生物發酵罐中，通過深層培養（液體發酵）技術生產的液體形態的食用菌菌種，其成本低，菌絲生長快，縮短生產周期[4]，菌種純度高、菌齡一致、萌發快，解決了固體菌種擴大生產中難以同步性生長的問題[5]，縮短養菌時間，出耳整齊，產業綜合效益穩步提高[6]。因此，黑木耳液體菌種代替傳統固體菌種愈來愈受到人們的關注[7]，并逐步應用到生產中。為此，筆者重點對黑木耳液體發酵、菌種制作的環境條件、儀器設備、培養基、搖瓶菌種、發酵菌種、菌齡等進行總結，旨在為黑木耳液體發酵菌種的制作提供技術參考。

1 環境條件

發酵菌種生產場所應遠離工礦業的“三廢”及微生物、粉塵、煙塵，至少300 m之內無禽畜場舍、屠宰場、垃圾場，無污水和其他污染源；用水應符合GB 5749的規定。生產車間地面應防水、防滲漏、防腐、防滑、易清洗，良好的排水系統；墻壁和天花板應能防水、防潮、防霉、易清洗；車間入口設置緩沖間，門窗安裝防蟲紗網。

2 儀器設備

不銹鋼發酵罐（包括空氣過濾器，與罐體串聯為一體）、空氣壓縮機、配電箱、高壓滅菌鍋、恒溫搖床、超凈工作臺、搖瓶、光學顯微鏡、酸度計等。發酵罐的質量應該符合GB 150的規定。

3 液體培養基

①玉米粉40 g∕L，淀粉 30 g∕L，牛肉膏3 g∕L，酵母膏 3 g∕L，磷酸二氫鉀2 g∕L，硫酸鎂 1 g∕L，維生素B15 mg∕L，花生油 0.5 mL∕L，pH 6.0～6.5。②玉米粉30 g∕L，淀粉40 g∕L，麩皮（煮汁）2 g∕L，酵母膏4 g∕L，磷酸二氫鉀3 g∕L，硫酸鎂1.5 g∕L，花生油0.5 mL∕L，pH 6.0～6.5。

4 搖瓶菌種制作

4.1 搖瓶培養基制作

液體培養基任選其一，玉米粉、淀粉先用溫水攪拌均勻，混合均勻，裝入搖瓶中，裝液量為搖瓶容量的60%～70%，聚丙烯薄膜封口。高壓蒸汽滅菌，121℃、0.11 MPa滅菌40 min，待壓力自然回零后開鍋取瓶。

4.2 接種培養

滅菌后搖瓶培養基冷卻至30℃以下，無菌條件下，挑取5～6塊1～4 mm2經活化的母種塊放入搖瓶內，封口，避光靜置24 h后置于恒溫搖床上，溫度24～28℃、轉速140～160 r∕min，培養7～8 d。

4.3 搖瓶菌種標準

培養液澄清透明不渾濁，無雜菌、無異味；菌絲球（或菌絲片段）均勻懸浮于液體中不分層，直徑不大于2 mm。

5 液體發酵菌種制作

5.1 滅菌與裝罐

臭氧機臭氧環境滅菌40 min，待臭氧耗盡后即可操作。液體培養基任選其一，培養液無結塊，打開罐蓋，裝入發酵罐內，加清水定容，裝液量為發酵罐容量的70%～80%。通入空氣攪拌1～2 min，混合均勻，密封蓋口。

5.2 滅菌

發酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20 cm，關閉進、排水閥門；高壓蒸汽滅菌，待壓力達到0.05 MPa時緩慢打開排氣閥降壓至0，關閉排氣閥，再次升壓至0.11 MPa，同時打開空氣過濾系統蒸汽滅菌50 min。

5.3 冷卻

滅菌結束，緩慢打開空氣過濾系統排水閥門和加熱層進水閥，加熱層立即通入冷水降溫，同時緩慢打開罐體排氣閥降壓。待發酵罐內壓力接近0時打開空氣壓縮機，經空氣過濾系統向罐體內通入無菌空氣，攪拌培養液，調整罐體排氣閥，維持罐壓正壓。發酵罐內培養液溫度降至30℃以下時，關閉進水閥門，調節排氣閥，維持罐壓0.04～0.05 MPa。

5.4 接種

關閉罐體進氣閥門和空氣壓縮機，調節罐體排氣閥，將罐壓降至0，無菌條件下（接種口用75%酒精擦拭，并用95%酒精灼燒，火焰圈套在接種口上）快速將搖瓶上的膠管插在接種口上，撤掉火焰圈，打開接種口閥門，接入已經確認無任何污染的搖瓶菌種，接種量1%～2%，關閉接種口。

5.5 培養

繼續通入無菌空氣，調節罐體排氣閥，維持罐壓0.01～0.03 MPa，培養溫度24～28℃，培養8～10 d。

5.6 質量檢測

接種后每間隔2 d，無菌條件下由取樣口取樣50 mL，接種于GB 4789.28規定的試管斜面或平板培養基上，置于30℃恒溫培養1～2 d，檢測有無雜菌侵染，確定繼續還是終止培養；取樣于光學顯微鏡下觀察菌絲體形態特點，若發現異常菌絲體則生長不良，終止培養；取樣測定菌液酸堿度，判斷菌液的優劣；也可鼻嗅罐體排氣閥排出的氣體味道，無異味，有培養基料香味及黑木耳特殊的味道可繼續培養，有酸臭味終止培養。四種檢測方法結合檢測效果最佳。

5.7 發酵菌種標準

培養液澄清透明不渾濁、稍黏稠，無雜菌、無異味；菌絲球（或菌絲片段）均勻懸浮于液體中不分層，直徑不大于3.5 mm。

6 菌種貯存

環境溫度低于20℃，搖瓶菌種可存放3～5 d；發酵罐內發酵菌種，持續通無菌空氣，保持罐壓0.01～0.03 MPa，可存放2 d左右。