Survivin、COX?2和P?gp在結直腸癌中的表達及臨床意義*

劉振興，梁金龍，楊雪峰，謝 銘（遵義醫學院附屬醫院胃腸外科，貴州遵義563003）

結直腸癌（CRC）又稱大腸癌，是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其發病率居我國消化系統惡性腫瘤的第1位[1]。近年來，隨著人口老齡化、飲食習慣及生活方式的改變，CRC的發病率呈逐年上升趨勢[2]。其早期癥狀隱匿、臨床發現多屬于中晚期、5年生存率低、預后較差，嚴重威脅著人類的健康[3]。因此，開展CRC的防治研究具有重要意義。CRC的發生與發展是一個極為復雜的過程，為了探討凋亡抑制蛋白（Survivin）、環氧合酶?2（COX?2）和 P?糖蛋白（P?gp）在 CRC 發病過程中的作用，本研究采用免疫組化方法檢測Survivin、COX?2和P?gp在CRC中的表達，并分析其相關性及與臨床病理特征的關系，從而為探索CRC新的診斷及防治方法提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1—12月本院60例臨床病理資料完整的CRC患者手術標本，取癌組織和其中20例患者的相應正常黏膜組織（距腫瘤大于10 cm）作為研究對象。60例患者中，男31例，女29例；年齡37～80歲，平均（60.2±12.5）歲；所有患者術前均未進行過放化療等相關治療，并排除CRC家族史和CRC術后復發者。60例患者均為腺癌，其中腫瘤直徑小于5 cm 34例，≥5 cm 26例；中高分化14例，低分化46例；腫瘤浸潤未及漿膜層19例，浸潤超過漿膜層41例；有淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移22例；CRC TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期33例。所有標本均經甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.2 方法

1.2.1 試劑與方法 Survivin兔抗人多克隆抗體、COX?2兔抗人多克隆抗體、P?gp兔抗人單克隆抗體、即用型抗鼠/兔通用免疫組化試劑盒均購自上海基因科技有限公司。采用免疫組化方法（GTVision法）檢測，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結果判斷標準 根據陽性細胞數及陽性信號出現的位置綜合判斷。Survivin、COX?2陽性染色定位于細胞漿和胞膜的棕黃色顆粒，P?gp陽性染色定位于細胞膜的棕黃色顆粒。細胞著色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分數（以 a表示）評分：0為 0分，0＜a≤25% 為 1分，25%＜a≤50% 為 2 分，50%＜a≤75% 為 3 分，75%＜a≤100%為4分；以陽性細胞數計分和著色強弱計分之乘積評定，＞3分者為陽性，≤3分者為陰性。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行分析。計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗；二者的相關性采用 Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Survivin、COX?2和 P?gp在 CRC 及正常結直腸黏膜組織的表達情況 Survivin、COX?2在CRC內主要表達于細胞質和細胞膜，P?gp主要表達于細胞膜。陽性表達結果為棕黃色顆粒（圖1～3）。60例CRC組織中Sur?vivin蛋白表達陽性43例，表達率為71.7%（43/60）；20例正常大腸黏膜組織內Survivin蛋白陽性表達率為15.0%（3/20），二者比較，差異有統計學意義（χ2=18.287，P＜0.01）；60例 CRC 組織中 COX?2蛋白表達陽性40例，表達率為66.7%（40/60）；20例正常結直腸黏膜組織內COX?2蛋白陽性表達率為20.0%（4/20），二者比較，差異有統計學意義（χ2=13.119，P＜0.01）；60 例CRC組織中P?gp蛋白表達陽性15例，表達率為25.0%（15/60）；20例正常結直腸黏膜組織內P?gp蛋白陽性表達率為10.0%（2/20），二者比較，差異無統計學意義（χ2=2.017，P＞0.05）。見表 1。

圖1 Survivin在CRC及正常結直腸黏膜組織內表達（400×）

圖2 COX?2在CRC及正常結直腸黏膜組織內表達（400×）

圖3 P?gp在CRC及正常結直腸黏膜組織內表達（400×）

表1 CRC、正常結直腸黏膜組織中Survivin、COX?2和 P?gp 的表達[n（%）]

2.2 Survivin和COX?2的表達與CRC臨床病理特征的關系 Survivin和COX?2二者均與浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分期相關（P＜0.05），而與CRC患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無相關性（P＞0.05）。見表2。

2.3 Survivin和COX?2在CRC中表達的相關性分析 43例Survivin蛋白陽性表達的CRC患者中COX?2蛋白的陽性表達為34例，17例Survivin蛋白陰性表達的CRC患者中COX?2蛋白的陽性表達6例，Spearman相關性分析顯示二者呈正相關（r=0.418，P＜0.01）。見表3。

表2 Survivin和COX?2異常表達與CRC臨床病理特征的關系（n）

表3 CRC患者Survivin和COX?2表達的關系[n（%）]

2 討 論

CRC是我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康，其發生是一個多因素、多步驟共同參與的復雜過程，而腫瘤患者的預后與其侵襲、轉移及對化療藥物的敏感性密切相關[4]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的一員，也是目前發現的最強的凋亡抑制因子[5]，含142個氨基酸，相對分子質量為16.5×103。Survivin具有腫瘤特異性表達的特點，其通過抑制Caspase?3和Caspase?7的活性，從而抑制腫瘤細胞凋亡[6]，促進細胞增殖，并通過對細胞G2/M期的調節，參與細胞周期調控、有絲分裂的過程，導致腫瘤細胞跳過細胞控制點而繼續增殖[7]。同時其具有促進腫瘤血管生成作用，參與腫瘤細胞的侵襲、轉移等生物學行為[8]。研究報道，Survivin在正常結直腸黏膜中呈無表達或低表達，在CRC組織中呈高表達，且與腫瘤的淋巴結轉移和臨床分期相關[9?10]。本研究結果顯示，CRC組織中Survivin蛋白表達陽性表達率為71.7%（43/60），明顯高于正常黏膜組織內表達陽性表達率15.0%（3/20），二者比較，差異有統計學意義（χ2=18.287，P＜0.01），其高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期密切相關（P＜0.05）。提示Survivin可能為CRC特異性表達的一種分子生物學改變，因此可作為CRC早期診斷和評判預后的指標。

COX是催化花生四烯酸轉化為前列腺素（PG）的關鍵酶，COX?2是其中一個亞型，在正常組織中無表達，其多種實體腫瘤的增殖、侵襲和轉移，并與其預后密切相關[11]。研究表明，COX?2也過表達于CRC中，與腫瘤臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關，并與基質金屬蛋白酶?2（MMP?2）呈協同效應，共同促進CRC的發生與發展[12]。COX?2高表達能夠促進PGs的合成，從而抑制腫瘤細胞的凋亡[13]。趙亞玲等[14]研究結果表明，塞來昔布能夠顯著下調COX?2蛋白表達水平，從而抑制人紅白血病HEL細胞增殖、遷移。COX?2可能通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡、誘導腫瘤血管形成、逃避生物體內細胞免疫監視作用等機制發揮抗凋亡作用[15]。本研究結果表明，COX?2蛋白在CRC組織中表達陽性表達率為66.7%（40/60），顯著高于正常黏膜組織內表達陽性率20.0%（4/20），二者比較，差異有統計學意義（χ2=13.119，P＜0.01），與 Survivin 蛋白表達相同，COX?2高表達也與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期密切相關（P＜0.05）。通過進一步分析，COX?2與Survivin在CRC組織中的陽性表達呈正相關（P＜0.05），提示二者共同促進了CRC的發生與發展。

P?gp是由多藥耐藥基因1（MDR1）編碼的跨膜糖蛋白，是一種腺苷三磷酸（ATP）依賴性外輸泵[16]。P?gp和ATP結合后，利用ATP供能，將化療藥物泵至細胞外，因此腫瘤細胞內的藥物蓄積下降，低于殺傷腫瘤細胞的水平，從而導致細胞產生耐藥，這種藥物外排機制稱為經典的多藥耐藥（MDR）機制[17]。趙崗等[18]采用Western blotting檢測CRC耐奧沙利鉑細胞HCT116/L、耐阿霉素細胞LoVo/adr及對應親本細胞中P?gp蛋白表達情況，結果顯示在耐藥細胞HCT116/L、LoVo/adr中P?gp高表達，而在親本細胞中未檢測到其表達。在本研究中，CRC組織內P?gp蛋白的表達陽性率25.0%（15/60）與正常黏膜組織內表達陽性10.0%（2/20）比較，差異無統計學意義（χ2=2.017，P＞0.05）。結合患者病史資料進行分析，由于患者術前均未進行過放化療等治療，并未產生化療藥物耐藥性，這或許是本實驗中CRC組織內P?gp低表達或無表達的主要原因。

綜上所述，本研究通過免疫組化方法，檢測了CRC組織與正常黏膜內 Survivin、COX?2和 P?gp的表達，結果顯示在CRC組織內Survivin和COX?2明顯高表達，而P?gp低表達或無表達。Survivin和COX?2的異常表達與CRC的侵襲，轉移密切相關，進一步分析表明二者的表達呈協同效應，提示二者共同促進CRC的發生與發展。通過研究其與CRC臨床特征的關系，可為CRC的診治及判斷預后提供新的理論依據。

[1]ZHENG R，ZENG H，ZHANG S，et al.National estimates of cancer prevalence in China，2011[J].Cancer Lett，2016，370（1）：33?38.

[2]徐玉彬，張培建，王超臣.結直腸癌的病因及發病機制的研究進展[J].中華臨床醫師雜志，2015，9（15）：2912?2915.

[3]DAVID KA，UNGER FT，UHLIG P，et al.Surgical procedures and postsurgical tissue processing significantly affect expression of genes and EGFR?pathway proteins in colorectal cancer tissue[J].Oncotarget，2014，5（22）：11017?11028.

[4]孫榮，姚健，楊志.結直腸癌患者的臨床特征及預后影響因素[J].中國腫瘤臨床與康復，2015，22（12）：1420?1422.

[5]CHENG XL，LI MK.Effect of topiramate on apoptosis?related protein expression of hippocampus in model rats with Alzheimers disease[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2014，18（6）：761?768.

[6]NIU Y，LI JS，LUO XR.Enhancement of expression of survivin promoter?driven CD/TK double suicide genes by the nuclear matrix attachment region intransgenicgastriccancercells[J].Gene，2014，534（2）：177?182.

[7]BOYKIN C，ZHANG G，CHEN YH，et al.Cucurbitacin Ⅱa：a novel class of anti?cancer drug inducing non?reversible actin aggregation and inhibiting survivin Independent of JAK2/STAT3 phosphorylation[J].Br J Cancer，2011，104（5）：781?789.

[8]張鑫，郝玉琴.靶向survivin shRNA在腫瘤治療中的研究進展[J].中國麻風皮膚病雜志，2016，32（1）：58?60.

[9]王林娜，侯素平，劉洪博，等.結直腸癌中REG4與survivin的表達及臨床意義[J].實用醫學雜志，2015，31（20）：3347?3350.

[10]薛軍，武雪亮，高曉斌，等.結直腸腺癌組織survivin和Ki?67的表達及其與預后的關系[J].基礎醫學與臨床，2015，35（11）：1526?1530.

[11]ABDELAAL ASMAA A，AFIFY RA，ZAHER AE，et al.Study of prognostic significance of marrow angiogenesis assessment in patients with de novo acute leukemia[J].Hematology，2015，20（9）：504?510.

[12]盧國豐，陳軍，劉菊林，等.COX?2和MMP?2在結直腸癌中的表達及其意義[J].胃腸病學，2014，19（10）：596?598.

[13]王志強，黃述斌，李松梅，等.環氧合酶?2及表皮生長因子在結直腸腫瘤中的表達及意義[J].安徽醫學，2015，36（11）：1361?1363.

[14]趙亞玲，劉貴敏，梁文同，等.COX?2抑制劑對人紅白血病HEL細胞增殖，凋亡及遷移的影響[J].南京醫科大學學報（自然科學版），2016，36（4）：435?439.

[15]MISRA S，SHARMA K.COX?2 signaling and cancer：new players in old arena[J].Curr Drug Targets，2014，15（3）：347?359.

[16]馮慧玲，熊玉卿.與P?糖蛋白及MDR1基因關聯的藥物轉運研究現狀[J].中國臨床藥理學雜志，2014，30（11）：1062?1064.

[17]張劍虹，張飛，張曉麗，等 .CerbB?2、MDR1/P?gp 蛋白在乙狀結腸黏液腺癌中的表達及意義[J].河北醫藥，2015，37（10）：1454?1457.

[18]趙崗，鄭泰浩，黃秀，等.結直腸癌中microRNA?451部分逆轉MDR1/P?gp途徑介導的多藥耐藥[J].第三軍醫大學學報，2016，38（2）：155?160.