一株尖孢鐮刀菌細胞色素P450氧化酶基因的克隆及生物信息學分析

單麗紅，姜冬冬，趙沙沙，黃佳佳，朱 麗，劉宏民

1)鄭州大學藥學院 鄭州 450001 2)鄭州大學新藥研究開發中心 鄭州 450001

屈螺酮及其類似物是一種高效、低毒、無不良反應的新一代甾體類避孕藥，最早是由Schering公司于2000年開發的第4代口服避孕藥[1]，具有抗鹽皮質激素和抗雄激素的作用，具有廣闊的市場前景[2]。課題組篩選到一株對去氫表雄酮(dihydroepiandrosterone，DHEA)具有羥基化作用的霉菌，經分子生物學的方法鑒定為尖孢鐮刀菌，暫編號為LZ22，目前國內外均未見其用于轉化DHEA獲得3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的報道。在微生物作用下甾體發生的羥基化離不開細胞色素P450氧化酶(CYP)。CYP為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白超家族，因其還原態與一氧化碳結合后在450 nm處的特征吸收峰而得名[3]。CYP一直是醫藥學關注的重點，CYP在甾體類生物轉化也成績斐然[4]。對羥化酶重組菌的研究[5]，一般集中在CYP基因的研究和改造。本課題組通過基因工程的手段，篩選到參與該催化過程的關鍵酶基因CYP6003A1。為了更好地闡述尖孢鐮刀菌LZ22菌株7α,15α-羥化酶系統的分子催化機制，本研究通過數據庫測序信息，采用PCR克隆了尖孢鐮刀菌LZ22菌株的CYP基因，并利用生物信息學對其產物的結構特征進行了分析。

1 材料與方法

1.1菌株及試劑尖孢鐮刀菌LZ22菌株(鄭州大學藥物研究院生物轉化實驗室自篩和保藏)，Trizol試劑(北京博邁德生物公司)，Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，PCR純化試劑盒(康寧生命科學有限公司)，cDNA合成試劑盒(TaKaRa公司)。培養基:葡萄糖3 kg/L，K2PO40.09 kg/L，蛋白胨1.2 kg/L，酵母膏0.1 kg/L。

1.2菌株培養30 ℃、190 r/min搖床培養菌株48 h后加入質量分數1% DHEA進行誘導，繼續培養48 h。

1.3RNA提取、cDNA合成與PCR擴增Trizol法提取以DHEA為底物誘導48 h的尖孢鐮刀菌的總RNA，反轉錄合成cDNA，取1 μL cDNA作為PCR擴增的模板。引物，上游5’-CGAAGAGAATGATT GAGAC-3’，下游5’-CGAAGGAAGAATGACAGAA-3’。PCR反應體系25 μL，包括上下游引物各1 μL,cDNA 1 μL，Taq DNA聚合酶12.5 μL ，水9.5 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環。

1.4CYP6003A1基因的生物信息學分析通過軟件拼接以及NCBI在線分析，得到CYP6003A1 cDNA全長以及對應的氨基酸序列。委托蘇州金唯智公司測序，將CYP6003A1基因的氨基酸序列通過NCBI上的BLAST進行在線比對[6]。將序列數據以fasta格式形成一個文件后，用ClustalX2進行全序列自動比對。輸出格式為Clustal格式(.aln)；利用MEGA 6.0進行系統發育分析。采用MEGA 6.0的鄰接法建樹。利用ExPASy在線蛋白質分析軟件ProtParam分析CYP6003A1基因編碼的氨基酸；利用PROFsec網站預測CYP6003A1蛋白的二級結構；利用丹麥理工大學生物序列分析中心提供的蛋白質三級結構預測服務器CPHmodels運用神經網絡進行同源建模預測蛋白質三級結構，并在Pymol中進行三維結構顯示，創建高品質的蛋白質三維結構。

2 結果

2.1尖孢鐮刀菌CYP基因的克隆從轉錄組數據庫中發現一個編碼CYP的基因，該基因的開放閱讀框為2 073 bp，預測編碼691個氨基酸的多肽。為克隆其完整的閱讀框架，利用上述總RNA，通過反轉錄合成cDNA，并設計了一對特異性引物，擴增出大約3 500 bp的片段，電泳結果見圖1，送蘇州金唯智公司全長測序，結果表明基因序列大小為3 459 bp。

1：CYP6003A1全長基因片段；2：DNA Marker圖1 尖孢鐮刀菌CYP基因PCR產物凝膠電泳圖

2.2尖孢鐮刀菌CYP基因的序列分析將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST搜索，發現尖孢鐮刀菌CYP與下列真菌的CYP基因具有很高的同源性：尖孢鐮刀菌EWZ38580.1、輪狀鐮刀霉菌EWG49946.1、燕麥鐮刀菌KIL95759.1、梨孢鐮刀菌OBS15561.1、禾生炭疽菌XP_008091343.1、彎頸孢霉KND86690.1、尖端賽多孢子菌XP_016646336.1、厚垣普奇尼亞菌OAQ60718.1、莢膜組織胞漿菌EEH05495.1；其中與尖孢鐮刀菌氨基酸序列一致性最高，其高度保守區域見圖2。BLAST比對結果顯示，與CYP6003A1相似度前10個基因有3個是CYP基因，其余均是與CYP基因相關的基因(圖3、4)。

圖2 尖孢鐮刀菌CYP基因與其他真菌的CYP基因氨基酸序列的多重比對結果

圖3 CYP6003A1氨基酸序列BLAST比對結果

圖4 尖孢鐮刀菌CYP基因 與其他9個真菌基因之間的親緣關系

2.3CYP6003A1氨基酸組成分析CYP6003A1蛋白氨基酸組成見表1。CYP6003A1等電點為6.78，蛋白質不穩定系數為34.47，屬于穩定蛋白質。利用PROFsec網站預測的CYP6003A1蛋白的二級結構見圖5。

表1 CYP6003A1蛋白的氨基酸組成分析

褐色：α-螺旋，38.31%;藍色：β-折疊，3.91%;白色：β-轉角，57.78%圖5 CYP6003A1蛋白二級結構預測分析

2.4CYP6003A1蛋白結構模擬對CYP6003A1蛋白三級結構進行分析發現，該基因包含CYP典型功能區：離子對結合區和血紅素結合位點，見圖6。

圖6 CYP6003A1蛋白三級結構示意圖

3 討論

本研究用Trizol法提取以DHEA為底物誘導48 h的尖孢鐮刀LZ22菌株的總RNA，通過PCR擴增克隆CYP基因并進行基因測序；運用生物信息學分析得到的cDNA序列[5]，成功擴增出全長3 459 bp的cDNA片段，測序后將序列提交至NCBI進行BLAST，發現CYP6003A1相似度前10個基因有3個是CYP基因，其余均是與CYP基因相關的基因。生物信息學分析結果顯示，該基因片段編碼691個氨基酸的多肽，并對CYP6003A1蛋白結構進行Pymol分子模擬，將CYP6003A1與其他真菌該蛋白質進行了同源性及進化樹分析。

屈螺酮是目前最好的第4代口服避孕藥物，具有重要的商業價值[2]。課題組篩選到一株能高效轉化DHEA 為7α，15α-二羥基DHEA的菌株，該產物可作為重要中間體合成屈螺酮，并且該路線簡便易行，收率較高，有望進一步降低屈螺酮的制備成本。

CYP在生物轉化合成屈螺酮關鍵中間體7α,15α-二羥基DHEA階段發揮重要作用[7]。CYP是藥物生物轉化反應的主要代謝酶。越來越多的CYP被發現參與了多種化合物的生物轉化[8]，尤其是后修飾過程，使得CYP在微生物新藥發掘領域脫穎而出[9]。

本研究通過克隆獲得尖孢鐮刀菌LZ22菌株CYP6003A1基因，并對其進行生物信息學分析，其結果一方面可為此類重組菌的構建奠定基礎，另一方面也可進一步豐富甾體羥化酶的研究內容，同時也可為解決甾體藥物羥基化反應收率低下的瓶頸問題提供新的思路和方法。

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