過表達GATA-4小鼠骨髓間充質干細胞修復心肌損傷的效果研究

賀繼剛，韓金秀，李貝貝，李宏遠，李洪榮，嚴丹

冠心病引起的心肌梗死(即心肌損傷)已成為目前世界范圍內的頭號“殺手”。目前國內外對心肌梗死的治療主要分為外科冠狀動脈旁路移植術、內科冠狀動脈支架介入治療及干細胞修復治療。細胞治療中應用最成熟的是骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），前期研究已經證明BMSCs可以修復心肌損傷［1］，但目前國內、外對干細胞療效的報道仍不盡然［1］。GATA-4是調控心臟基因表達的重要轉錄因子，參與心臟正常發育、功能基因表達和心肌肥大的病理過程。本研究擬利用慢病毒攜帶GATA-4基因轉染小鼠BMSCs，探討過表達GATA-4-BMSCs修復心肌損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 于2015年3月—2016年12月，選取60只健康4周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，由成都達碩實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(川)2015-030。動物喂養、觀察均按照藥物非臨床研究質量管理規范（GLP）規定執行。

1.2 主要試劑和儀器 C57BL/6小鼠BMSCs培養基（低糖培養基，含10%胎牛血清），購自美國Cyagen Biosciences公司。CD29、CD44、CD11b、干細胞抗原1（SCA-1）抗體購自美國BioLegend公司。CD11bMicroBeads購自美國Miltenyi公司。番茄凝集素購自美國Sigma公司。C-kit抗體購自美國eBioscience公司。PHILIPS EPIQ 7C心臟超聲儀購自荷蘭PHILIPS公司。熒光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3 小鼠BMSCs分離、培養及鑒定 將小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡15 min，取出股骨和脛骨，再以75%乙醇浸泡Ⅰ～Ⅱ min，置于0.9%氯化鈉溶液中，兩端剪斷暴露骨髓腔。1 ml注射器加0.9%氯化鈉溶液沖出骨髓，收集至無菌離心管中，以1 500×g離心10 min，以含10%胎牛血清的C57BL/6小鼠BMSCs培養基重懸細胞制備細胞懸液，以2×106/cm2密度接種至25 cm2塑料培養瓶，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。并標記為原代。胰酶消化傳代至第3代時采用CD11b磁珠負選，去除造血干祖細胞。繼續傳代至第7代，取生長至第7代的BMSCs，待細胞融合達80%～90%時，制備單細胞懸液，采用流式細胞檢測CD29、CD44、CD11b、SCA-1（PE-CD29單抗 5 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl、PE/Cy5-CD445 μl按 1∶20 稀釋至 100 μl、PE-CD11b單抗 5 μl按 1∶40 稀釋至 100 μl、FITC anti-mouse SCA-1 5 μl按1∶20 稀釋至 100 μl）。

1.4 慢病毒載體及基因開啟技術構建過表達GATA-4-BMSCs 由上海吉凱基因化學技術有限公司提供GATA-4基因及GV308質粒，將已構建成功的GATA-4基因插入慢病毒包裝質粒GV308中，構建GV308-GATA-4重組慢病毒包裝質粒，然后將其轉染入小鼠BMSCs并加入基因開啟劑多西環素（DOX）。轉染成功后利用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測轉染72 h后過表達GATA-4-BMSCs中GATA-4 mRNA表達水平，以未轉染為陰性對照組，實驗重復3次。

1.5 小鼠心肌梗死模型的建立 取20只小鼠，直視下氣管插管與小動物呼吸機連接，由第3肋間進入胸腔，以肺動脈圓錐與左心耳右緣之間交點和心尖的假想連線為小鼠冠狀動脈前降支走行標志，以9-0縫線于左心耳根部下方縫扎。縫扎的方向和左心耳的下緣平行。縫扎成功標志為左心室前壁及心尖周圍心肌組織運動減弱。縫合肋骨，關閉肋間隙。心肌梗死模型建模96 h時行病理切片證實建模是否成功。

1.6 檢測過表達GATA-4-BMSCs修復心肌損傷的效果

小鼠心肌梗死模型建模后48 h，將2.5 mmol/L（106/L細胞中加入2 μl濃度為2.5 mmol/L的Dir）BMSCs（n=3）、空載體-BMSCs（n=3）、過表達GATA-4-BMSCs（n=3）500 μl經尾靜脈注射，并給予喂食含有DOX（0.25 mg/L）的液體。并將心肌梗死未處理組（n=3）及正常小鼠（n=3）同時給予喂食含有DOX（0.25 mg/L）的液體作為對照1組及對照2組。給予干預措施72 h后，采用心臟彩超（PHILIPS EPIQ 7C）評估心功能指標，包括射血分數（EF）、環比收縮（FS）、環比舒張直徑（LVIDd）、環比收縮直徑（LVIDs）。

1.7 相關指標的測定 完成心臟彩超后增加正常小鼠正常喂養（n=3）作為對照3組，將各組小鼠開腹后經下腔靜脈注射番茄凝集素（50 μg/ml；25 μl/10 g），于注射10 min后完成心臟小動物活體成像檢測心臟區域熒光強度，將心臟分成兩部分放入4%多聚甲醛固定，一部分完成冰凍切片，采用熒光共聚焦顯微鏡（Nikon90i）檢查心肌血管數量。一部分完成石蠟包埋切片，按C-kit說明書采用免疫組化檢測心肌梗死局部C-kit陽性細胞數量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數資料的分析采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠BMSCs流式細胞儀鑒定結果 小鼠BMSCs CD29表達率為98.0%，CD44表達率為100.0%，CD11b表達率為0.1%，SCA-1表達率為99.5%。

2.2 RT-PCR方法檢測GATA-4 mRNA表達水平 陰性對照組GATA-4 mRNA表達水平為（0.57±0.34），過表達GATA-4-BMSCs組GATA-4 mRNA表達水平為（78.17±1.32），兩組GATA-4 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（t=2.576，P＜0.05）。

2.3 小鼠心肌梗死模型病理檢測結果 造模96 h后，心肌梗死模型小鼠左心腔變大，HE染色鏡下可見心肌梗死部位細胞排列紊亂，外形結構輪廓不清，細胞水腫、壞死（見圖1、2）。

圖1 心肌梗死模型組織大體觀Figure 1 Tissue view of myocardial infarction model

圖2 心肌梗死模型HE染色鏡下觀（×200）Figure 2 HE staining of myocardial infarction model

2.4 各組小鼠心功能指標變化值比較 各組小鼠LVIDd、LVIDs變化值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組小鼠EF、FS變化值比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中對照2組FS惡化幅度低于對照1組，BMSCs組、空載體-BMSCs組、過表達GATA-4-BMSCs組EF、FS改善幅度高于對照1組和對照2組，過表達GATA-4-BMSCs組EF、FS改善幅度高于BMSCs組和空載體-BMSCs組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 各組小鼠心功能指標變化值比較（x±s）Table 1 Comparison of cardiac indexes changes in each group

2.5 各組小鼠心臟區域熒光強度比較 各組小鼠心臟區域熒光強度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中BMSCs組、空載體-BMSCs組、過表達GATA-4-BMSCs組心臟區域熒光強度高于對照1組、對照2組和對照3組；過表達GATA-4-BMSCs組心臟區域熒光強度高于BMSCs組和空載體-BMSCs組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表2、圖3）。

表2 各組小鼠心臟區域熒光強度比較（x±s）Table 2 Comparison of fluorescence imaging of cardiac in each group

圖3 各組小鼠心臟熒光成像圖Figure 3 Fluorescence imaging of cardiac in each group

2.6 各組心肌血管數量比較 各組心肌血管數量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中對照2組心肌血管數量多于對照1組，對照3組心肌血管數量多于對照1組、少于對照2組，BMSCs組、空載體-BMSCs組心肌血管數量多于對照1組、少于對照2組和對照3組，過表達GATA-4-BMSCs組心肌血管數量多于對照1組、少于對照2組和對照3組、多于BMSCs組和空載體-BMSCs組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表3、圖4）。

2.7 各組小鼠C-kit陽性細胞數量比較 各組小鼠C-kit陽性細胞數量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中對照2組、對照3組C-kit陽性細胞數量少于對照1組，BMSCs組、空載體-BMSCs組C-kit陽性細胞數量多于對照1組、對照2組和對照3組，過表達GATA-4-BMSCs組C-kit陽性細胞數量多于對照1組、對照2組、對照3組、BMSCs組、空載體-BMSCs組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表4、圖5）。

表3 各組小鼠心肌血管數量比較（x±s，個/高倍鏡）Table 3 Comparison of number of myocardial vessels in each group

表4 各組小鼠C-kit陽性細胞數量比較（x±s，個/高倍鏡）Table 4 Comparison of number of C-kit positive cells in each group

3 討論

GATA結合蛋白是具有Ⅳ型鋅指結構的轉錄因子。最近有研究表明，在房間隔缺損患者中，特別容易觀察到GATA-4的C末端鋅指結構發生改變；而此區域是DNA連接區，也是協同分子作用的區域，而DNA連接區域的改變也引發了轉錄活動的下降［2］。脊椎動物有兩類GATA結合蛋白，其中，GATA-1/2/3參與造血系統調控；GATA-4/5/6參與心臟、腸及外胚組織中的基因表達調控。GATA-4是調控心臟基因表達的重要轉錄因子，參與心臟正常發育、功能基因表達和心肌肥大的病理過程。而GATA-4在心臟發育的早期起重要作用，抑制其表達，可阻斷p19畸胎瘤細胞向心肌細胞分化，強表達則增強心肌分化［3］。通過采取反義策略，對GATA-4進行剔除可阻止前體心臟細胞的分化，而利用功能增益方法刺激GATA-4的表達可誘導出現異位收縮的心肌細胞，因此，表明GATA-4可介導心肌的分化、增殖和存活［4］。

本實驗基于上述研究通過向小鼠BMSCs轉染GATA-4，進而增強BMSCs修復心肌損傷的能力。本研究結果表明，過表達GATA-4-BMSCs組在給予干預措施72 h后，EF及FS差值改善幅度最大，可以更好地改善心功能，且心臟區域熒光強度最強，說明GATA-4-BMSCs具有更強的“歸巢”效應。

圖4 番茄凝集素評估各組心肌血管數量（×100）Figure 4 The number of myocardial vessels in each group by tomato lectin

圖5 免疫組化評估各組C-kit陽性細胞數量（免疫組化，×400）Figure 5 The number of C-kit positive cells in each group by immunohistochemistry

番茄凝集素與存在灌流的血管內皮細胞上的N-乙酰葡糖胺低聚物結合，因此可直接標記有灌流的血管，而無灌注的血管不會被標記。因此定量番茄凝集素標記的血管數量提供了一種直接測量心肌灌注功能的方法。由于GATA-4具有促進心血管發育的作用［5-6］，本研究在完成心臟彩超后開腹經下腔靜脈注射番茄凝集素，采用熒光共聚焦顯微鏡檢查心肌血管數量。結果顯示過表達GATA-4-BMSCs組表達出更多的血管。

心肌干細胞（cardiac stem cells，CSC）是TORELLA等［7］從老鼠心臟中分離出的一種固有CSCs。隨后MESSINA等［8］報道成體心臟含有心臟干/祖細胞，如：C-kit+［9］、SCA-1+［10］、ISL-1+ 和邊緣細胞。本實驗采用C-kit作為標志性分子，評估GATA-4動員心肌梗死局部C-kit陽性細胞的能力。結果顯示過表達GATA-4-BMSCs組C-kit陽性細胞數量多于其他組。

綜上所述，過表達GATA-4-BMSCs可以通過增強“歸巢”效應、促進心肌梗死局部血管增生、有效動員C-kit陽性細胞修復心肌損傷。

作者貢獻：賀繼剛、嚴丹進行文章的構思與設計、統計學處理、結果的分析與解釋、論文修訂、負責文章的質量控制及審校、對文章整體負責，監督管理；賀繼剛、韓金秀進行研究的實施與可行性分析、撰寫論文；韓金秀、李貝貝、李宏遠進行數據收集；賀繼剛、李洪榮進行數據整理。

本文無利益沖突。

［1］HE J，TENG X，YU Y，et al.Injection of Sca-1+/mouse bone mesenchymal stromal-like cells improves cardiac function in a mouse myocardial infarct model［J］.Differentiation，2013，86（1/2）：57-64.DOI：10.1016/j.diff.2013.07.002.

［2］HARRELSON Z，KAESTNER K H，EVANS S M.Foxa2 mediates critical functions of prechordal plate in patterning and morphogenesis and is cell autonomously required for early ventral endoderm morphogenesis［J］.Biol Open，2012，1（3）：173-181.DOI：10.1242/bio.2012040.

［3］RIAZI A M，TAKEUCHI J K，HORNBERGER L K，et al.Nkx2-5 regulates the expression of beta-catenin and GATA4 in ventricular myocytes［J］.PLoS One，2009，4（5）：e5698.DOI：10.1371/journal.pone.0005698.

［4］MYSLIWIEC M R，CARLSON C D，TIETJEN J，et al.Jarid2 （jumonji，AT rich interactive domain 2） regulates NOTCH1 expression via histone modification in the developing heart［J］.J Biol Chem，2012，287（2）：1235-1241.DOI：10.1074/jbc.M111.315945.

［5］BRODY M J，CHO E，MYSLIWIEC M R，et al.Lrrc10 is a novel cardiac-specific target gene of Nkx2-5 and GATA4［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，62：237-246.DOI：10.1016/j.yjmcc.2013.05.020.

［6］ESTRUCH R，ROS E，SALAS-SALVADó J，et al.Primary prevention of cardiovascular disease with a mediterranean diet［J］.N Engl J Med，2013，368（14）：1279-1290.DOI：10.1056/NEJMoa1200303.

［7］TORELLA D，INDOLFI C，GOLDSPINK D F，et al.Cardiac stem cell-based myocardial regeneration：towards a translational approach［J］.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2008，6（1）：53-59.

［8］MESSINA E，DE ANGELIS L，FRATI G，et al.Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart［J］.Circ Res，2004，95（9）：911-921.DOI：10.1161/01.RES.0000147315.71699.51.

［9］BOLLINI S，SMART N，RILEY P R.Resident cardiac progenitor cells：at the heart of regeneration［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50（2）：296-303.DOI：10.1016/j.yjmcc.2010.07.006.

［10］JEZIERSKA-WOZNIAK K，MYSTKOWSKA D，TUTAS A，et al.Stem cells as therapy for cardiac disease—a review［J］.Folia Histochem Cytobiol，2011，49（1）：13-25.