脂肪干細胞降低光老化皮膚黑色素含量的實驗研究

隋冰　王微　李春陽　張春陽　馬旭　李慶春

[摘要]目的：觀察脂肪組織來源干細胞（ADSCs）對光老化皮膚中黑色素含量的降低作用。方法：將6周齡裸鼠（18～22g）雙側耳背部皮膚每2d紫外線光照一次，每次30min。持續4周后，通過觀察皮膚變化和Fontana-Mas soil染色，確立光老化模型。每只裸鼠隨機選取一側耳背部皮下注射ADSCs溶液，對側給予等量的平衡鹽溶液（HBSS）。通過Fontana-Mas son染色觀察皮膚中黑色素含量。結果：ADSCs注射組黑色素少于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：光老化可導致皮膚黑色素含量增加，而脂肪干細胞可以降低光老化皮膚中黑色素的含量。

[關鍵詞]脂肪干細胞；黑色素；光老化；紫外線

[中圖分類號]R758.1 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）06-0079-03

皮膚老化受多種因素的影響，包括內源性及外源性因素，臨床表現為皮膚變薄粗糙、色素沉著、色斑形成、彈性差、順應性差、皺紋增多及毛細血管擴張等。內源性老化與年齡、遺傳因素、免疫功能及內分泌因素有關，受基因的調控，是不可抗拒的力量。外源性因素以紫外線輻射的作用最為明顯，也被稱之為光老化，其中長波紫外線（UVA）及中波紫外線（UVB）的影響最為突出。異常色素沉著也是皮膚光老化的一種表現形式，主要是由于紫外線輻射導致的表皮黑色素的增加。雖然黑色素能抵御紫外線的輻射，但由此產生的黑色素聚集加深了皮膚的顏色，導致皮膚局部色斑的形成。

脂肪干細胞（ADSCs）是從脂肪組織中分離的一種間充質干細胞，具有多向分化特性。Kim等人通過皮下注射ADSCs證明其通過旁分泌的功能增加膠原蛋白的合成、真皮厚度、膠原密度以及無毛小鼠的成纖維細胞數量，同時促進新生血管的生成。本次實驗以裸鼠光老化模型為研究對象，觀察紫外線照射后黑色素的增加情況，并通過注射脂肪干細胞，探索ADSCs對光老化皮膚黑色素含量的降低作用。

1材料和方法

1.1材料：6周齡裸鼠（體重18～22g），sD雄性大鼠（體重80～120g）。所有的實驗動物，由哈爾濱醫科大學附屬二院動物實驗室提供，經哈爾濱醫科大學倫理委員會審批通過。紫外線燈管TL20 W/12RS（Philips，Amsterdam，The Netherlands）。

1.2方法

1.2.1細胞培養：脂肪干細胞取自SD雄性大鼠的附睪脂肪組織。將無菌環境下提取的脂肪組織置于培養皿中，經PBS液洗滌后對脂肪組織進行粗剪，移至無菌試管中用0.5%的Ⅰ型膠原酶在37℃震蕩消化處理1h；加入10%胎牛血清（FBS）終止消化，以速度1200r/min，離心10min；丟棄上層淡黃色物質，保留沉淀細胞，再將沉淀細胞用含有10%胎牛血清和雙抗（100U/m1）的DMEM重懸后，接種到無菌的培養瓶中；在37℃飽和濕度的無菌培養箱中培養，傳至第三代備用。

1.2.2建立裸鼠皮膚光老化模型：照射組裸鼠用紫外線燈管對雙側耳背部進行隔日照射，調整小鼠箱的高度，使照射距離為20～30cm約150mJ/cm²，每次持續30min，共累計照射4周。觀察至皮膚出現部分變紅、褶皺、色素沉著。非照射組裸鼠除不進行紫外線照射外，其余條件均相同。4周后，各組隨機選取4只裸鼠頸脫法處死，進行FontanaMasson染色證實光老化模型建立成功。

1.2.3注射ADSCs溶液：將脂肪干細胞（1×10⁶）懸浮于30ul的平衡鹽溶液（HBSS）中，末次照射后從實驗組中隨機選取20只裸鼠，用微量注射器隨機注射至一側耳背部皮下區域（左耳10只，右耳10只，隨機選自不同照射箱），將30μl HBSS注入另一側作為對照組。28d后，所有小鼠處死，兩組耳背皮膚分別從注射點向邊緣切割5mm，得到的組織常規縱軸中線切片。將切片進行Fontana Masson染色（黑色素染色法：硝酸氨銀經黑色素的作用還原為黑色的金屬銀）。

1.2.4黑色素含量測定：在同倍視野下（200×），記錄黑色素點狀聚合團與線狀聚合團的數量，點狀聚集為多個黑色素不連續聚合成團，且間距小于自身體積；線性聚集為多個黑色素交聯聚合成團。所有樣本均由有經驗的病理學家在雙盲條件下進行。組織學評估黑色素細胞分布情況分為4級，①0分：黑色素點狀聚合成團分布小于5個；②1分：黑色素點狀聚合成團分布大于5個；③2分：黑色素線狀聚合成團分布小于5個；④3分：黑色素線狀聚合成團分布大于5個。

1.3統計學分析：所得評分結果分別由均數±標準差表示，采用軟件SPSS19.0進行獨立樣本t檢驗，P<0.05表示有統計學意義。

2結果

2.1光老化模型觀察結果：組織切片可見照射組經過紫外線照射后真皮結構不清，膠原纖維含量減少，排列紊亂，不均勻分布，表皮增厚、連續性中斷，黑色素明顯增加，見圖1A；非照射組皮膚結構完整清晰，具有正常厚度，膠原纖維均勻分布，有序排列，見圖1B。

2.2ADSCs對光老化皮膚黑色素含量的影響測定結果：3只裸鼠不明原因死亡，在剩余17只裸鼠中左耳ADSCs組、右耳ADSCs組各選8只進行比對。Fontana Masson染色可見ADSCs組在同一視野下黑色素含量小于HBSS組，見圖2；黑色素分布評價得分，ADSCs組小于HBSS組，兩組差異具有統計學意義（P<0.05），見圖3。

3討論

色素沉著是一種很常見的皮膚疾病，可以出現在所有類型的皮膚中。任何一種炎癥或損傷幾乎都可以直接引起皮膚的色素沉著。色素異常沉著是皮膚光老化的一種重要表現形式，相比于自然老化的不可調控性，對皮膚光老化的治療成為減緩皮膚老化進程的關鍵，目前已進行了多種嘗試，主要包括激光、藥物、射頻和外科手術等方法。相比于手術，多數患者更傾向于選擇非手術治療。面部色素異常沉著、皺紋等均可通過激光治療得到明顯改善，但同時伴隨的嚴重并發癥、較長的治療周期成為激光治療光老化的致命缺陷。

ADSCs具有自我更新和分化成不同類型細胞的能力，可以從病人自己的身體中分離且不受排斥反應的影響。隨著醫學技術的日益發展，將會有效地應用于各種疾病的治療。再生醫學的初步臨床試驗正在進行，其中包括替代糖尿病小鼠的胰島β細胞、小鼠的脊柱融合及周圍神經再生等。Kim等人通過B16黑色素瘤細胞的體外實驗證實了ADSCs的美白效果。認為其是應用了脂肪干細胞分泌因子的旁分泌作用，通過TGF-β₁作用于黑色素合成通路，抑制酪氨酸酶及其相關蛋白的表達。本實驗雖未研究相關機制，但與Kim得到了相似的研究結果。

在本次研究中選取6周齡裸鼠建立皮膚光老化模型，隨著紫外線輻射時間的增加，可以觀察到小鼠耳背部皮膚逐漸變紅，粗糙，彈性降低，褶皺形成，直至皮膚脫屑，色素斑塊異常沉積。相比于使用裸鼠建立光老化模型，SD大鼠雖然具有價格便宜、體表面積大、易于操作和易于固定等優點，但建模花費時間較長，一般需要8～12周，并且大鼠的毛發茂盛，需要定期修剪，影響對皮膚變化的觀察。

實驗所選80～120g的SD大鼠，是當前提取ADSCs較簡單的鼠類，既保證了脂肪干細胞較高的成活率，也降低了移植到受體后裸鼠的死亡率。有相關文獻報道移入受體的脂肪干細胞完全代謝大約需要28d，因此本次實驗選擇在注射ADSCs溶液28d后做組織切片，這樣保證了干細胞有足夠的時間發揮其作用。評分方法是對相關實驗評分的改進，相比分光光度計吸光度檢測和酪氨酸酶活性檢測，此法操作簡便，成本更低，效率較高，對皮膚光老化表現提供直觀證據，也為ADSCs對黑色素的作用提供了統計學數據。

綜上，光老化可導致皮膚黑色素含量增加，而脂肪干細胞可以降低光老化皮膚中黑色素的含量。

[收稿日期]2017-01-21

[修回日期]2017-05-28

編輯/張惠娟endprint