法氏囊活性肽BP-I對禽流感H9N2滅活疫苗的免疫佐劑特性

（河南科技大學 動物科技學院，河南洛陽 471023）

1 前言

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是禽類B 細胞生長的最初發生位置，B 細胞生長成熟后由此轉移至周邊淋巴器官定居與增殖，實現免疫功能。法氏囊微環境里具備多種促使B 淋巴細胞生長的生物活性物質，近年來，法氏囊組織里陸續分離鑒定出多條活性肽，其中BP-I是從法氏囊組織中新分離的生物活性肽，其免疫學作用尚不清晰，本研究擬通過人工合成法氏囊生物活性肽BP-I和禽流感H9N2滅活疫苗配合運用接種小鼠，通過測定小鼠體內免疫指標水平變化評價BP-I對禽流感H9N2滅活疫苗免疫佐劑特性，開拓了佐劑的研發領域。

2 試驗材料與方法

2.1 主要材料

28日齡BALB/c普通級老鼠80只購自河南鄭州大學實驗動物中心，公母對半；禽流感疫苗（H9N2 亞型，SDS696株）購自乾元浩生物股份公司；禽流感病毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）和pET32a-HA（H9N2）質粒，由本實驗室保存。BP-I標準品由上海科肽生物科技有限公司合成，純度＞95%。HRP標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體、TMB 底物、顯色液均購自鄭州鼎國生物技術有限責任公司；小鼠細胞因子含量測定 ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 動物分組及免疫

將80只28日齡BALB/c小鼠隨機分為4組，每組20只，分別是PBS組，單獨疫苗組、單獨疫苗+BP-I組和空白組，采取肌肉注射（i.m.）方式分別對各組小鼠（空白組除外）進行兩次免疫，每次免疫間隔2周，即所有組分別于0、14d進行首免和二免。

2.2.2 血清IgG抗體的測定

首免后7、21d分離小鼠血清，并采用ELISA方法檢測小鼠血清 H9N2 HA 抗體。

2.2.3 血清中IL-4和IFN-γ的測定

首免后7、21d對小鼠進行采血，如圖2-2-d所示，并分離小鼠血清，采用小鼠細胞因子含量測定 ELISA 試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。每次分析時，使用對照的細胞因子標準品繪制標準曲線，通過標準曲線來計算血清中細胞因子的含量。

2.2.4 動物免疫保護試驗

二免2周后（即首免后28d），經口服途徑對各實驗組小鼠（20只/組）攻擊H9N2型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）100 μL（2.5×106TCID50/0.1 mL），設空白對照組，攻毒后各組小鼠隔離飼養。于攻毒后第7d分別從各組隨機抽取5只小鼠分離其肺臟，制作肺臟的HE切片來分析病變情況。HE染色及切片的制備委托武漢谷歌生物有限公司完成。

2.2.5 統計學處理

3 結果

3.1 免疫小鼠血清中IgG抗體水平

于首免后7、21d分離小鼠血清進行IgG 抗體檢測，結果如圖1所示，首免后7d和21d時，疫苗+BP-I組和疫苗組小鼠血清中IgG抗體分泌水平均顯著高于PBS組（P＜0.01），疫苗+BP-I組小鼠血清IgG抗體分泌水平顯著高于疫苗組（P＜0.01），且首免后21d時較首免后7d時各組IgG抗體水平均進一步提高。表明法氏囊活性肽BP-I 能顯著提高免疫H9N2型AIV疫苗后小鼠IgG抗體分泌水平。

圖1 免疫 小鼠血清IgG抗體平均水平

3.2 小鼠血清細胞因子水平

首免后7、21d分離小鼠血清，采用小鼠細胞因子含量測定ELISA 試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量，以分析BP-I對H9N2型AIV疫苗免疫后小鼠的細胞免疫水平的影響。IL-4的分泌水平如圖2所示，7d與21d時均是：疫苗+BP-I組和疫苗組的細胞因子IL-4的分泌水平差異不顯著（P＞0.05），疫苗組與PBS組的IL-4的分泌水平差異極顯著（P＜0.01），疫苗+ BP-I組與PBS組的IL-4的分泌水平差異極顯著（P＜0.01），表明法氏囊活性肽 BP-I對于提高免疫后小鼠體內細胞因子IL-4分泌水平作用不顯著。IFN-γ的水平變化如圖2所示，7d與21d時均是：疫苗+BP-I組和疫苗組小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均顯著高于PBS組（P＜0.01），疫苗+BP-I組小鼠血清中IFN-γ的分泌水平顯著高于疫苗組（P＜0.01），且首免后21d時較首免后7d時各組IFN-γ的分泌水平均進一步提高，表明法氏囊活性肽BP-I能夠提高免疫后小鼠體內細胞因子IFN-γ的分泌水平。

圖2 免疫后各組小鼠細胞因子IFN-γ和IL-4水平變化

圖3 小鼠免疫后各組肝脾指數變化

3.3 小鼠肝臟和脾臟指數變化分析

小鼠的肝臟和脾臟指數的變化如圖3所示，首免后7d和21d時均是：疫苗+BP-I組與疫苗組的肝指數差異不顯著（P＞0.05）；疫苗+BP-I組和疫苗組的脾指數差異不顯著（P＞0.05）。說明法氏囊活性肽BP-I對免疫后小鼠的肝指數和脾指數變化的作用不顯著。

3.4 免疫小鼠的免疫保護試驗

由于H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）不能使小鼠出現明顯的臨床癥狀和導致死亡，為有效評價各實驗組小鼠免疫保護力的差異，于二免2周后，對小鼠攻擊A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）100 μL（2.5×106TCID50/0.1 mL），同時設空白對照組，在攻毒后7d從各組隨機抽取5只小鼠采集其肺臟，制作肺臟的HE切片，和正常肺臟相比，PBS組肺泡壁出血嚴重，肺泡腔內出現大量漿液和中性粒細胞；疫苗組與PBS組相比，肺泡壁出血減少、中性粒細胞減少；疫苗+BP-I組與疫苗組相比，肺泡壁出血明顯減少、中性粒細胞明顯減少。表明法氏囊活性肽BP-I配合疫苗能夠有效促進小鼠肺臟中病毒的清除，從而對小鼠起到免疫保護的效果。

4 討論

血清IgG抗體水平能夠反映被免疫動物的體液免疫應答能力，其檢測結果準確性較高，并且檢測操作步驟比較簡便。本試驗結果顯示，法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2滅活疫苗，在兩次免疫后可以顯著增強小鼠血清中IgG抗體水平，提高機體的體液免疫水平，對特異性免疫應答調節有著重大意義。細胞因子是一組在體內免疫細胞或非免疫細胞中產生的異質性肽類調節因子。細胞因子具有廣泛的生物活性，對免疫應答的產生和調節具有重要作用，是評價機體細胞免疫狀況的一個重要的免疫指標。細胞因子在體內能激活和調節免疫活性細胞，IL-4和IFN-γ分別為Th2和Th1類免疫反應的代表性細胞因子。試驗結果顯示法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2滅活疫苗免疫小鼠能夠顯著提高IFN-γ的分泌水平，對IL-4的分泌水平影響不顯著，能夠提高機體細胞免疫水平。小鼠脾臟的變化情況能夠表現總體的免疫變化，肝臟也是重要的臟器，而且取材較方便。肝脾指數可以較好地反映出小鼠機體的免疫情況。本實驗在首免后7d和21d時隨機取小鼠的肝、脾并稱重，并計算肝脾指數。結果表明：疫苗+ BP-I組的肝指數和疫苗組差異不顯著；疫苗+ BP-I組的脾指數和疫苗組差異不顯著。說明法氏囊活性肽BP-I與疫苗配合使用對小鼠肝臟和脾臟指數變化影響不大。本試驗在二免2周后對小鼠進行動物免疫保護試驗。由于選用的 H9N2亞型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）不能使小鼠出現明顯的流感臨床癥狀和導致死亡，而且以2.5×106TCID50的劑量感染小鼠后該病毒主要分布在其肝臟、脾臟和肺臟，其中肺臟中的帶毒量最多。因此，為有效評價BP-I的佐劑特性，我們只做了HE切片，結果顯示，攻毒后7d時疫苗+BP-I 組幾乎觀察不到小鼠肺臟的病變。表明BP-I 配合疫苗使用能夠抑制AIV 在小鼠肺臟中的復制。

法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用能顯著提高小鼠血清中IgG抗體的分泌水平。能顯著提高小鼠血清內細胞因子IFN-γ的分泌水平，對IL-4的分泌水平影響不大。對小鼠的肝臟和脾臟指數變化的作用不顯著。法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用會增強對小鼠肺臟的免疫保護作用。

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