種植體周圍炎對成骨細胞影響的體外研究

孫 華，李仲賢

(梅州市人民醫院廣梅院區口腔門診，廣東 梅州 514031)

種植義齒是牙列缺損及缺失的常見的修復方式之一，大約30%的種植修復的患者會發生種植體周圍炎[1]，這種復雜的炎癥及免疫病理過程是導致種植體失敗的主要原因。菌斑是種植體周圍組織炎癥的主要致病因素，炎癥微環境可以導致破骨作用，使支持骨喪失，最終導致種植義齒修復失敗。研究證實，種植體周圍炎的發生直接影響種植牙的成功率。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，在骨形成過程中要經歷成骨細胞增殖、細胞外基質成熟、細胞外基質礦化和成骨細胞凋亡4個階段。很多因素可調節這幾個階段，從而最終調控骨形成。種植體周圍炎治療的傳統方法，包括局部清創、刮治及抗菌藥物應用，整體治療效果并不十分理想。并且抗菌藥物應用因其對宿主細胞毒性及細菌的耐藥性，使其應用具有一定爭議[2]。本試驗以體外培養種植體周圍炎來源及正常組織來源的人成骨細胞(osteoblast，OB)為研究對象，重點觀察炎性微環境對成骨細胞增殖、分化成熟方面的影響。為抑制牙周炎、種植體周圍炎等所致牙槽骨的吸收，促進骨再生提供理論依據，促進種植修復技術的臨床推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胎牛血清、胰蛋白酶、 培養液DMEM(Gibco公司)、茜素紅(AZR)染料、二甲基亞砜(DMSO)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色及活性試劑盒、骨鈣素(osteocalcin，OCN)放免試劑盒。

1.2 成骨細胞原代分離培養 取種植體脫落患者種植窩中骨組織及口腔頜面外科手術中獲得的無菌骨碎片，在DMEM 全培養液中輕刮骨內表面并反復沖洗，將骨片剪成碎片，將其置入培養瓶中。培養瓶倒置放入CO2培養箱，靜置4 h后，取出培養瓶小心翻轉。每3 d換液1次，每次換液后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態、運動及貼壁情況。待細胞數量足夠，0.25%胰酶消化傳代。

1.3 細胞形態學觀察與功能鑒定 (1)ALP染色：將細胞爬片3 d后取出，按照試劑盒說明書染色，光鏡觀察。(2)鈣結節染色：將細胞爬片18 d后取出，茜素紅染色5 min，二甲苯透明，樹膠封固，光鏡觀察。

1.4 進行炎性微環境對成骨細胞功能影響的試驗

1.4.1 試驗分組 將種植體周圍炎來源成骨細胞組設為試驗組，將正常組織來源成骨細胞組設為對照組。

1.4.2 成骨細胞增殖能力檢測(MTT法) 取傳代第三代細胞，胰蛋白酶消化離心加入DMEM培養液，形成OB混懸液，接種于96孔板。每24 h每組取3孔，收集細胞，加入MTT溶液孵育4 h，加二甲基亞砜，酶標儀測定490 nm處各管吸光度值(A值)，繪制生長曲線。整個試驗重復3次。

1.4.3 堿性磷酸酶活性 取傳代第三代細胞，培養72 h后，收集細胞測定各管OD值。根據計算公式計算出蛋白含量。按照AKP測定試劑盒說明書操作，據計算公式計算出各組細胞勻漿液AKP的含量。整個試驗重復3次。

1.4.4 骨鈣素檢測 取傳代第三代細胞，培養72 h后，收集細胞上清液作骨鈣素檢測。按骨鈣素放射免疫試劑盒所提供的放射免疫法(RIA)測定細胞分泌到培養基中的骨鈣素含量。整個試驗重復3次。

1.5 統計學處理 試驗所得數據應用Microsoft Excel及SPSS 11.5軟件，采用獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 培養后成骨細胞的鑒定

2.1.1 細胞形態學觀察 兩種來源細胞原代培養第1天，貼壁的細胞開始形成突起。此時細胞體積小，呈短梭形、三角形或多邊形。隨著傳代次數的增加，細胞以三角形及方形為主，生長快而穩定，就細胞形態而言，兩組細胞無明顯差異。

2.1.2 堿性磷酸酶染色 兩種來源細胞傳3代以后，ALP染色顯示大部分培養細胞呈陽性，細胞漿有藍染顆粒或塊狀沉淀，為ALP陽性反應。但對照組比試驗組細胞內可見更多染色顆粒。

2.1.3 鈣結節染色 細胞生長8～14 d細胞融合后繼續培養，即呈多層生長，培養18～30 d，倒置顯微鏡下觀察可見在瓶底的不透光結節，茜素紅染色可見結節處有橘紅色鈣鹽沉積，證實為鈣化結節。對照組比試驗組細胞內可見更多鈣結節。

2.2 成骨細胞成骨功能觀察

2.2.1 成骨細胞增殖能力測定 結果表明，兩組細胞都表現了一定的增殖能力，對照組增殖能力明顯高于試驗組，從貼壁培養第4天，兩組細胞增殖能力有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.2 堿性磷酸酶(ALP)活性 試驗組ALP活性(4.21±0.25)U/gprot，對照組ALP活性(8.91±0.29)U/gprot，組間差異有統計學意義(P<0.01)，表明兩組均可使成骨細胞ALP活性增強，對照組ALP活性高于試驗組。

2.2.3 骨鈣素(OCN)檢測 試驗組OCN含量(2.40±0.26)ng/mL，對照組OCN含量(3.40±0.36)ng/mL，組間差異有統計學意義(P<0.01)，表明兩組均可使成骨細胞OCN含量增加，對照組OCN表達高于試驗組。

3 討 論

種植義齒修復經過長期的基礎研究和臨床應用，已經逐漸普及，與之相應的種植體周圍炎的患者日趨增多，因種植體周圍骨吸收導致種植體脫落占脫落種植體的97.06%，現已成為種植修復一大難題。

種植體周圍炎早期主要研究相關炎癥細胞因子及細菌微生物對骨細胞的影響，與骨吸收的關系，研究已證實齦溝液中IL-1α、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子參與炎癥過程 ，與界面骨破壞有關[3]。目前，在種植體周圍炎的治療上，針對細胞及免疫病理方面的研究較多，Bhattarai等[4]證實，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)主要表達于脂肪組織和免疫系統，通過結合殼聚糖納米金粒子，在植入物表面可以誘導成骨細胞礦化，抑制種植體周圍炎。還有學者研究釉基質衍生物可以影響植入物表面OB的增殖及分化，褪黑素可以調節成骨細胞的代謝[5-6]，都具有一定的應用前景。丁元圣等[7]研究表明，含氟鎂合金正畸微種植體可促進成骨細胞增殖，對種植體周圍炎能起到一定的抑制作用。常壓低溫等離子體(cold atmospheric plasma，CAP)能夠破壞細菌生物膜，增加鈦表面潤濕度，有利于成骨細胞的附著，可能被用于種植體周圍炎的治療[8]。骨形成蛋白2和牙周膜干細胞在種植體周圍炎形成的缺損處可增加新骨的形成，并重新形成骨整合[9]。骨形成蛋白2/7異質二聚體也可增加骨再生[10]。

成骨細胞的鑒別除細胞形態外主要依靠成骨細胞的特異性分泌蛋白，如堿性磷酸酶、骨鈣素及體外礦化的功能特征。長期以來各研究者均以具有以上特征作為成骨細胞鑒定標準，因而將這些特點稱為成骨細胞表型標志[11-12]。

本試驗細胞通過形態學同時結合成骨細胞的3項特征性指標，證實培養的細胞為成骨細胞，并有鈣化能力。種植體周圍炎來源的成骨細胞的增殖及分化能力均低于正常組織來源的成骨細胞。這是由于種植體周圍炎的炎性微環境抑制了成骨細胞的增殖能力。種植體周圍炎來源的成骨細胞由于在炎性微環境下降低了OCN 的表達，與以往研究相符合[13]。種植體與頜骨的骨結合區骨密度越高，種植體與骨的結合率就越高[14]。

炎性微環境下成骨細胞的生物學功能受多方面調控，通過對比可以確定炎性微環境下成骨細胞的生物學功能受到影響，成骨分化及礦化能力顯著降低，這是導致種植體周圍骨組織吸收的主要原因[15]。本試驗在細胞層面進一步探討種植體周圍炎的病因，從而為疾病防治提供了方向。

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