心肌梗死中lncRNAs、mRNAs基因表達譜分析

李珊珊，王悅竹，宋一帆，白雪峰

（哈爾濱醫科大學大慶校區醫學信息學院，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

心血管病患病率及死亡率仍將不斷上升，而其中尤其嚴重的是急性心肌梗塞。臨床上急性心肌梗死發病率高，預后多不良，已經引起醫學界的高度關注。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是全球范圍內指致死和致殘的主要疾病之一。

國內外對心肌梗死的生物學標志進行了大量而廣泛的研究。研究發現lncRNA在心肌梗死中更為靈活的調控多個mRNA在通路中的異常表達。

研究證實，有些lncRNA通過靶向作用于其他基因參與調控病理性心肌細胞凋亡[1]，有些lncRNA在梗死組織中被發現通過抑制其表達可以減弱心肌梗死[2-3]。還有些在外周血中被發現這些lncRNA可能在AMI的發展中具有潛在作用[4-5]。lncRNA還可作為 ceRNA參與調控細胞死亡，Wang等[6]發現了一種lncRNA APF(autophagy promoting factor)可以調節細胞自噬。人體發生急性心肌梗塞后體內的mRNAs和lncRNAs表達異常，通過轉錄后水平參與MI及其并發癥的病理生理過程，有望成為急性心肌梗死新的生化標志物和治療靶點。

本文根據mRNA與lncRNA的概述以及近年來心肌梗塞與mRNA和lncRNA的相關研究進程來討論mRNA-lncRNA相互作用的調控機制對心肌梗死發生與發展過程的影響，為研究者在mRNAs、lncRNAs和AMI診斷方面的研究提供幫助。

1 lncRNA與心肌梗塞

1.1 數據準備

我們從NCBI上下載平臺數據（GPL96）、基因芯片數據（GSE974）和GENECODE數據庫中下載人類的基因序列，利用計算機軟件建庫比對，對lncRNA與mRNA進行分離。芯片數據包括38個病人樣本（16 normal/22 MI），對平臺數據進行探針重注釋得出11083個mRNA和382個lncRNA。通過SAM算法選取差異基因，通過R語言進行數據處理選取的差異的mRNA和lncRNA（foldchange＞2）,得到了9937個差異mRNA和86個差異lncRNA。這些差異表達的mRNA和lncRNA作為心肌梗死的潛在致病因素。利用R語言構出mRNA與lncRNA互做網絡（pearson＞0.8）用Cytoscape插件對網絡進行功能模塊挖掘，獲得5個功能顯著性模塊，最后通過David進行基因的功能注釋，結果見圖1。

1.2 表達譜網絡分析

得到mRNA-lncRNA互作網絡，結點數1309個，其中包含1276個mRNA和33個lncRNA，1680條邊。網絡圖中的點代表基因，邊表示兩個基因間的聯系，其中度越大的基因表示與其連接的基因越多，表明在網絡中可能起著重要作用。另外，還存在一些雖然度小但在網絡圖中起橋梁作用的結點。這些節點可能作為MI中的潛在的致病基因。

圖1 數據分析流程圖

1.3 網絡模塊挖掘

對HPRD網絡與共表達網絡進行整合構建更為全面的lncRNA-mRNA互作網絡，其中包括33個lncRNA，4522個mRNA，9134條邊。利用Cytoscape中的JActivemodule和Netmine插件進行模塊挖掘。獲得5個功能性顯著模塊（module1-module5）。

1.4 Gene ontology(GO)分析

通過David在線平臺進行對模塊中重要基因進行功能注釋，篩選出具有診斷意義的基因。分析后的結果發現lncRNA在心肌梗死發病機制中扮演多重角色。

2 結果

2.1 差異表達lncRNAs、mRNAs

圖2 lncRNA 表達譜熱圖

圖3 mRNA 表達譜熱圖

對MI表達譜數據進行處理，得到的差異lncRNA與mRNA數量分別為86/9937個 。我們根據foldchange值進行排序，提取了差異mRNA前0.5%的表達譜與差異lncRNA前5%的表達譜繪制熱圖，結果見圖2、3。樹狀圖表示對來自不同樣本的不同基因的聚類分析結果，從整體上來看疾病組與對照組在基因表達上有顯著差異。

2.2 miRNAs-mRNAs網絡模塊

對建立的疾病網絡已經證明顯現冪律分布[7],從網絡分析來看，網絡中結點度越大的點，表明可能會影響更多的鄰居結點，因此，這些點被考慮扮演hubs結點的角色。圖4顯示lncRNAs-mRNAs網絡結點的度分布是冪律分布。通過模塊挖掘來研究lncRNAs、mRNAs在癌癥當中的共調控方式、以及基于局部策略來分析miRNAs的在心肌梗塞中的功能。

圖4 網絡度分布

根據得到的5個功能模塊當中，大部分 lncRNAs具 有 較 大 的 度， 如：LINC00483、AL031598、AC009283、AC126365、H19、AP000654等，結果見表1。在各個模塊中有些結點的度較大，AP000654在模塊四、五的度數為：18、20。模塊一中度較大的節點GNAQ,它的度數為17，同時該基因已被研究證實參與調節多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡，并在損傷和動脈粥樣硬化的血管中參與反應。研究表明有多個基因能夠促進動脈粥樣硬化,例如：lncRNA H19通過調節MAPK和NF-kB信號通路來促進動脈粥樣硬化的形成[8]。動脈粥樣硬化可能會導致人體發生心肌梗死。模塊二中度較大的節點IGF2R可能在調節心肌細胞生長和凋亡中發揮重要作用[9]。模塊四中的MMP1，MMP2，MMP7，MMP9，MMP12和MMP13 也被文獻證實在心肌梗死發病機制中起到重要作用[10]。

表1 各模塊中邊、點數量和所含lncRNAs,mRNAs數量

在五個模塊中，對模塊進一步分析，通過clusterone插件對模塊進行挖掘，通過挖掘每個模塊中重要節點用紅色標出，結果見圖5。這表明除了度大的點起到了HUB結點的作用，在網絡中還有一些結點度雖然小，在局部聯系較為緊密，成為一個團隊發揮著作用,這些合作的結點可能在疾病發生過程中起到作用。在模塊二中TGFA、MAGI2、ADAM17聚在一個集合中，其中已被研究證實的增強ADAM17表達與大鼠急性心肌梗死后心肌重塑相關[11]。模塊四中ZC3H12A是位于人類一號染色體上的基因，已有文獻證實該基因與AHSP、HBA2存在互作關系。基因ZC3H12A別名為MCPIP，近期研究發現MCPIP在缺血心肌組織中的表達可以通過調節局部心肌炎癥來保護MI后的心臟重塑[12]。

圖5 lncRNAs-mRNAs功能顯著性模塊

2.3 模塊功能分析

根據得到的五個模塊的功能注釋結果，我們發現多個模塊中的多個基因都被注釋到血管內皮生長因子的生產調節、炎癥反應、細胞凋亡，結果見圖6。其中模塊三中的C3和C5被注釋到與血管內皮生長因子的生產調節與炎癥反應。模塊一中的基因還被注釋到多對相反功能上，如：regulation of apoptotic process in bone marrow和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway，regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway。這表明其實組織中本身就存在平衡調控機制，若這些機制失衡也會導致疾病發生。

3 結語

圖6 模塊功能注釋

為了探究心肌梗死中lncRNA與mRNA的調控機制，我們通過對心肌梗死芯片數據進行分析，得到lncRNA-mRNA網絡，并且對網絡進行模塊挖掘獲得五個顯著性模塊，對模塊進行分析LINC00483、AL031598、AC009283、AC126365、H19、AP000654在網絡中起到了HUB節點的作用，在網絡中還有一些結點度雖然小，但在局部聯系較為緊密，成為一個團隊發揮著重要作用, 如：TGFA、MAGI2、ADAM17。其中regulation of apoptotic process in bone marrow和negative regulation of vascular endothelial growth factor signaling pathway出現在多個模塊功能注釋中。通過本文的研究，發現lncRNA與mRNA協同作用，為研究者在lncRNAs、mRNAs和MI診斷方面的研究提供幫助。

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