循環腫瘤DNA在結直腸癌臨床診療中的應用價值研究

楊燕峰，潘琴，王純

溧陽市人民醫院腫瘤內科，江蘇常州 213300

近期國內相關研究表明，結直腸癌發病率在我國居所有惡性腫瘤的第三位，且呈逐年上升態勢；該病致死率高，早期結直腸癌（Ⅰ、Ⅱ期）患者接受治療，5年存活率為75%～90%，而晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者的5年生存率僅為40%～55%，因此早期發現、早期治療對于改善結直腸癌患者預后具有顯著積極意義。但CRC并無典型早期癥狀，多數早期患者僅表現為局部隱痛或大便形狀改變等，至癥狀較為明顯時，多已進展至中晚期。既往臨床多從活檢組織標本中獲得腫瘤特異的生物信息，但活檢標本系由傾入性操作獲得；而有些學者通過唾液、尿液等代謝物進行篩查的結果顯示其敏感性、特異性較差。ctDNA是由腫瘤細胞釋放的DNA片段，可于外周循環中直接檢測，為CRC的早期診斷提供了可能，基于此，該研究對ctDNA在結直腸癌臨床診療中的應用價值進行探討分析，綜述如下。

1 生物學特性

ctDNA的來源與釋放機制目前醫療界尚未達成共識，多數學者認為其是由實體腫瘤細胞破裂或凋亡而釋放出的游離基因片段，大小約為0.18～21kb，來源包括循環腫瘤細胞（CTC）、腫瘤原發灶及轉移灶，其中凋亡是主要釋放機制，同時也包括分泌、壞死等方式；但釋放水平及速率尚不明確。研究表明[1-2]，ctDNA具有如下生物學特征：①ctDNA來源于腫瘤原發灶、轉移灶，甚至殘留微小病灶等機體所有荷瘤部位，因而能夠對腫瘤整體特征進行全面反應；②不同類型癌癥患者ctDNA含量基線水平波動較大，同一癌癥患者個體間差異也較為明顯，且其含量水平隨惡化程度及“腫瘤負荷”實時變化，因此較高的ctDNA水平常代表癌癥已進展至晚期或較差的預后；③ctDNA半衰期較短，在血液循環中的半衰期＜2 h，因而血中濃度是對機體腫瘤狀態的實時反映；④因腫瘤細胞有克隆性質，因此ctDNA攜帶有特異性的遺傳信息，其核酸序列與腫瘤特異性核酸序列高度一致，分析ctDNA的基因變異類型與數量，有助于確定對該變異類型敏感的靶向藥物[3]。

2 ctDNA的檢測

2.1 樣本制備

采集血漿、血清均可檢測ctDNA，但血清中雖然有較多數量及較高純度的DNA，同時其也具有易降解的特征。因而，異常基因檢測的陽性率不夠理想，且若血液凝固后，血細胞將逐步裂解，向血清中釋放正常DNA，影響檢測結果的準確性。因此，采用血漿檢測ctDNA是目前臨床最佳取樣方法，血漿處理的過程中，應注意將血液置于含有EDTA的抗凝血劑中，離心處理后使用專用試劑盒提取。為提高檢測的準確性，檢測樣本的采集與提取中的具體事項如下：采新鮮外周血后應及時放入含細胞防腐劑和ECTA-K3抗凝血劑的ctDNA BCT試管中；輕柔倒轉試管8～10次以保證成分的充分混合；4～37℃下常溫運輸、保存，無需冷凍儲藏。

2.2 檢測方法

定性和定量是目前結直腸癌患者ctDNA檢測的兩種方向，其目的分別在于確定腫瘤的存在及惡性程度，以二代測序（NGS）為基礎檢測、以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎擴增是目前常用的兩大平臺檢測技術，其中前者多用于批量基因、外顯子及基因組的ctDNA檢測，具有較高的效率；后者則多用于檢測某一特定基因或數個基因的ctDNA，在保證特異性的同時具有較好的敏感性。

3 ctDNA在治療中的應用

3.1 早期診斷

Tie等[4]研究表明，ctDNA水平檢測在早期篩查、早期診斷中具有重要價值，其研究結果顯示健康人的血清DNA、CEA水平均顯著低于結腸癌患者，提示聯合檢測能夠作為早期篩查指標且特異性較高；有學者在100例健康者與229例行化療的轉移性結直腸癌患者的對比研究中發現后者的ctDNA水平明顯較高[5]。但對于早期患者而言，血液ctDNA水平檢測目前仍屬于探索階段，僅可作為某些熱點突變的初篩或腫瘤組織檢測的補充，但較高的特異性和能夠避免組織活檢所造成創傷的優點顯示了其良好的應用前景。

3.2 判斷療效

隨著近年來結直腸癌治療研究的不斷進展，抗腫瘤藥物呈多樣化態勢不斷出現，因而如何及時評定治療效果以指導臨床已成為目前腫瘤治療的挑戰之一。既往研究證實，結直腸癌患者ctDNA濃度及變異特征能夠如實、高效反映腫瘤變化情況，且在評估如腫瘤是否完全切除、某藥物對患者的治療效果方面具有一定價值。閆巍[6]等研究結果顯示，手術切除腫瘤3d后結直腸癌患者的ctDNA水平較術前有一過性升高，術后14～30 d的水平則較術前顯著下降；同時有研究證實結直腸癌患者術后ctDNA呈明顯的下降趨勢，而于病情復發患者中則可見ctDNA水平的升高。以上研究均提示ctDNA水平及變化情況能夠體現腫瘤進展狀況，同時特異性ctDNA的變化與腫瘤負荷存在關聯性。

3.3 指導靶向用藥

表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子（VGEF）靶點的單克隆抗體藥物是目前已獲得臨床使用批準的兩類結直腸癌靶向藥物，其中前者以帕尼單抗、西妥昔單抗為代表，后者以貝伐珠單抗為代表，盡管在2017年的NCCN指南[7]中已不再推薦可切除肺或肝轉移瘤的結腸癌患者在新輔助化療中應用靶向藥物，但對需聯合用藥及復發轉移化療無效的患者，靶向治療仍為一線或者二線用藥。研究表明[8]，KRAS野生型結直腸癌患者采用抗EGFR單克隆抗體可獲得顯著的生存獲益，但存在KRAS基因突變或NRAS突變的結直腸癌患者并不能從使用抗EGFR藥物中獲益；因此在靶向藥物治療前，需對NRAS和KRAS進行檢測，而如使用石蠟包埋的組織這一最為準確的突變檢測方法，需一黃豆大小體積的組織，但對于已發生術前遠處轉移、術后復發遠處轉移無法手術的患者而言，組織獲取較為困難，同時可引起穿孔等嚴重并發癥[9]。ctDNA則在組織獲取方面具有顯著優勢，僅需采集10 mL的外周血即可完成基因測序，患者易于接受，且可重復獲取。研究表明[10-11]，不同腫瘤部位、原發腫瘤和轉移灶或同一腫塊不同部位的腫瘤細胞基因突變情況具有一定差異性，這種差異性將致使組織標本基因檢測結果的局限性，無法全面反映整體腫瘤細胞的突變情況，從而對靶向治療效果產生一定影響；而ctDNA可由全身腫瘤細胞壞死凋亡后釋放至血液循環，因此，具有很強地全身腫瘤細胞突變的代表性，因而能夠克服腫瘤的異質性，更好的指導靶向用藥。

3.4 評估預后

大部分結直腸癌患者治療后，其機體內多數腫瘤細胞由免疫系統吞噬，但仍有新腫瘤灶出現的可能，常規影像學方法僅可滿足評價未行手術切除患者的放療、化療或靶向治療的效果，但因體積的限制，該方法不適用于對于腫瘤復發轉移的監測。ctDNA最早應用于乳腺癌及肺癌的預后監測，其變化情況與腫瘤發展具有高度一致性；ctDNA較短半衰期的特性使其能夠與實時反映腫瘤變化情況，加之其來源主要為腫瘤細胞，特異性也較高。Diehl等[12]研究結果顯示，對結腸癌術后患者進行連續ctDNA突變情況檢測能夠很好的監測腫瘤復發，其特異度、靈敏度均接近100%。因此，隨著術后監測隨訪時間的延長以及ctDNA研究的日趨深入，可以預見將有更多更具說服力的研究證實ctDNA在評估結直腸癌患者預后及復發中的應用價值。

4 小結

目前ctDNA的檢測和分析方法尚無標準，每種方法的指標、適用人群及癌癥類型均不盡相同，但ctDNA作為新型腫瘤標志物，具有顯著的微創、操作簡單、可重復獲取、實時、準確等優點，能夠較好的克服腫瘤異質性，已顯示了其在結直腸癌臨床應用中的廣泛前景。可以預見，如能克服研究樣本量不足、標本無法長期保存等技術問題，在此基礎上充分結合影像學檢查、常規腫瘤標志物與液體活檢技術，結直腸癌患者的診療將會更加個體化、精準化，從而顯著提高生活獲益，改善預后。