繡球花組織培養的研究進展

閆海霞+蔣月喜+鄧杰玲+黃昌艷+何荊洲+卜朝陽??

摘要：【目的】對國內繡球花的組織培養研究進行了概述，為繡球花的組織培養提供參考。【方法】從外植體的獲得、初代培養、增殖培養、生根培養以及移栽等方面的研究進展進行重點闡述，討論分析目前繡球花組織培養中存在的問題以及今后的研究方向。【結果】我國的繡球花組織培養研究起步較晚，雖取得了一定進展，并逐步建立了一套繡球花快速繁殖的體系，但仍然存在部分問題。【結論】目前的繡球花組織培養研究仍較欠缺。

關鍵詞：繡球花；外植體；生根

中圖分類號：S682文獻標識碼：A文章編號：1003-4374（2017）03-0039-05

Abstract：【Objective】It aims to summarize the research of the tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla，and provides reference for its cultivation【Methods】Existing problems in the cultivation of [WTBX]hydrangea macrophylla and the future research directions are elaborated，based on the research progress with the acquisition of explants，primary culture，propagating culture，rooting culture and transplanting【Results】The research on the tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla in China started lateAlthough some progress has been made and a system for the rapid propagation of hydrangea has been established，problems still exist【Conclusion】At present，the research on tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla is still deficient

Key words：[WTBX]hydrangea macrophylla；explant；rooting

繡球花（Hydrangea macrophylla）屬虎耳草科八仙花屬的落葉灌木[1]，別名眾多，如草繡球、陰繡球、八仙花、粉團花、紫陽花等，原產日本以及中國四川一帶，現世界現各地均有栽培。半陰、溫暖濕潤的環境是繡球花的極佳生長環境，在富含腐殖質、濕潤、排水良好的酸性土壤上生長更好。繡球花可入藥，其葉片含有繡球酚和繡球酚8OβD葡萄糖糖苷等成分（Asahina Y，1929）以及甘茶葉素[2]，可見其是具有較高的開發利用價值的。此外，其花朵碩大而艷麗，花色豐富，當土壤pH為4～6時花呈藍色，當土壤pH為75以上則呈紅色，因此可作為測定土壤酸堿度的指示植物[3]。繡球花的繁殖方法以扦插為主，但繁殖系數低，繁殖速度慢，無法滿足規模化生產的需要，在一定程度上限制了優良新品種的快速繁殖以及工廠化生產。組織培養繁殖系數大，繁殖速度快，不會因發生變異而使有利變異性狀喪失，為滿足人們對有利變異的需要提供了可能[4]。國外對于繡球花研究主要集中在歐美、日本，這些國家對繡球花的資源及育種的研究較早，并且培育出了不少的園藝栽培品種，由于缺乏一套適宜的繡球花快繁技術，并未進行大面積推廣。國內首次成功報道了繡球花的離體快繁技術是在1998年[5]，隨后有關繡球花的組培研究逐年增多。本文主要綜述國內外對繡球花的組織培養研究進行，并就現今存在的問題以及今后研究方向提出相應建議，旨在為研究繡球花的組織培養技術，對其育種、良種繁育提供一定的參考。

1外植體的獲得

植株的任何一部分均可作為外植體，在繡球花的組織培養研究中，帶腋芽莖段、莖尖、葉片、葉柄、葉塊是常用的外植體，而種子、根系或花器官為外植體的研究尚未見報道。繡球花最早使用葉片為外植體的是Sebastian與Hearser[6]。馮潤東等[7]以莖段、葉片和莖尖為外植體，并將莖段分為中部、下部兩種類型，葉片分為成熟葉、嫩葉兩種類型進行研究，發現：葉片污染率最低，但不易形成愈傷組織，莖尖污染率較高，但可誘導出側芽。邢合龍等[8]同樣認為葉片不易形成愈傷組織更不能形成不定芽，莖尖雖然污染率略高于但死亡率較低，主要是因為：莖尖本身污染程度低，而其他部位除了嫩葉片都與外界接觸時間較長，葉片雖污染少，但不容易形成愈傷組織，更不能快速形成不定芽，與快速繁殖相悖，所以選用莖尖為外植體。還有研究表明，葉柄是適宜的外植體的，如范小峰等[9]通過比較莖段、葉柄、葉塊的組培研究發現，莖段、葉柄、葉塊均可作為離體培養的外植體，其中葉柄的誘導效果最好。由上可知，外植體的選擇受植物自身基因型的決定，同時還受外植體類型、自身狀態的影響。

外植體的消毒滅菌是組織培養取得成功的關鍵一步。消毒劑的種類很多，常用的是將75%酒精和01%HgCl2兩者結合使用，還有采用酒精結合次氯酸鈉進行消毒滅菌的。酒精穿透力極強，可排除材料上的空氣以利于其它消毒劑的進入，因此，酒精通常與其他消毒劑結合使用，并被用作表面消毒的第一步。HgCl2的消毒效果也很好，但滅菌時間過長對培養物會有毒害作用，從而影響外植體的成活率，HgCl2是有毒物質，從環保的角度來說是不利于環保的[10]。研究表明繡球花的外植體消毒采用常規消毒即可達到很好的效果，區別在于消毒劑的滅菌時間長短。雷亞靈[9，10]認為最好的消毒方式為70%酒精浸泡30s后再用01%HgCl2消毒10min。唐曉杰等[12]則以70%酒精消毒30-45s后再利用01%HgCl2滅菌7min，效果最好。任叔輝[13]指出：HgCl2、次氯酸鈉及升汞次氯酸鈉組合都能很好的起到滅菌消毒效果，但滅菌時間過長，會使外植體部分葉片變黃，甚至出現褐化現象。殷麗青等[14]在進行組培研究時，針對露地栽培植物的器官或組織雜菌多，滅菌困難的情況，采用了一個較特別的方法：在材料萌芽前，先用硫酸紙將枝條頂端套起，待新枝萌芽后取其莖段用75%乙醇處理30s后，再用飽和漂白粉上清液滅菌15-20min，滅菌效果較好，且避免去了使用HgCl2，此方法低碳環保。綜上可知，消毒劑的滅菌時間長短對外植體的污染和成活率影響很大，因此在篩選適宜的滅菌方法時，要兩者兼顧。

2初代培養

初代培養也稱啟動培養，指的是將外植體首次接種在培養基上進行培養的階段，其目的是獲得無菌的材料。經過初代培養的外植體可以通過愈傷組織途徑或者不定芽途徑獲得組培苗。愈傷組織途徑又叫間接途徑，指外植體先脫分化為愈傷組織，再由愈傷組織分化形成叢生芽，然后生根形成完整植株。不定芽途徑也叫直接途徑，即指不經愈傷組織階段而直接脫分化產生器官。繡球花的組織培養研究采用兩種方法均可進行，但以不定芽途徑為主，愈傷組織途徑為輔。

21不定芽途徑的啟動培養

繡球花初代培養以MS培養基為基本培養基，并在MS上添加不同種類和濃度的激素，這類啟動培養基有MS+6-BA 05mg/L+IBA 05mg/L[12]、MS+6-BA 30mg/L+NAA 01mg/L[15]、MS+6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L+GA3 10mg/L[16]。也有部分研究的初代培養基以1/2MS為基本培養基，在1/2MS上添加不同種類和濃度的激素，如1/2MS+6-BA 01mg/L+NAA 01mg/L是嫩莖側芽生長的理想培養基[4]。啟動培養基中添加的6-BA、NAA、IBA、GA3，其濃度因品種而異。研究表明，6-BA和NAA的濃度配比對莖段的誘導效果不同，高濃度的6-BA會抑制芽的伸長，苗短小瘦弱，而高濃度的NAA也會抑制芽的萌發，在MS+6-BA 05mg/L+NAA 02mg/L培養基上，芽的啟動率高，生長較快，且健壯[17-19]。當6-BA濃度大于20mg/L時，芽的誘導受到抑制作用，而當NAA濃度大于05mg/L時，不定芽基部產生愈傷組織并表現出細弱的現象，其中在培養基6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L上，芽的誘導率最高，達972%，是適宜的啟動培養基[14]。

22愈傷途徑的愈傷組織誘導及分化

繡球花的啟動也可通過另一種方式發生，即愈傷組織途徑。但愈傷組織的誘導和分化受外植體的遺傳因素及本身的生理生化影響很大，且因植物種類和部位不同而不同，產生這種差異的主要原因是植物體內的內源細胞分裂素與生長素的絕對含量和相對比例。

愈傷組織的誘導和分化受激素種類及濃度的影響很大。細胞分裂素的主要作用是誘導愈傷組織，生長素則有利于愈傷組織的分化，但單一使用某一種生長素并不利于愈傷組織的分化，將細胞分裂素和生長素合理地配合使用對愈傷組織的分化極為有利。孫曉榮等[20]將絨繡球的莖尖、側芽或莖段接種到不同的8種培養基上，其中以MS+6-BA 05-10mg/L +IAA 01-02mg/L的分化率最高。范小峰等[9]認為適合繡球花愈傷組織誘導的最佳培養基為MS+6-BA 10-20mg/L+NAA 005mg/L，誘導率達875%，適合愈傷組織分化的最佳培養基為MS+6-BA 20mg/L+NAA 05mg/L。雷亞靈[10]（2008a）經過深入研究發現：最佳愈傷組織誘導培養基為：MS+6-BA 10mg/L+IBA 10mg/L，誘導愈傷率達92%。最佳愈傷組織增殖培養基為：1/4MS+6-BA 05mg/L+IBA 02mg/L，增殖系數可達92；最佳的愈傷組織分化培養基為：MS+TDZ 01mg/L+IBA 05mg/L，分化率達48%。韓玉林[21]經過相關實驗表明：誘導愈傷組織形成的培養基為MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L，不定芽分化的培養基為MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L。由上可知，繡球花的愈傷誘導與分化通常采用的細胞分裂素為6-BA，生長素則以IBA或者NAA為主。

3增殖培養

快繁是指快速繁殖，增殖培養是快繁的決定性因素，影響快繁的主要因子是增殖培養基的選擇，其中包含基本培養基以及培養基中的激素組合以及濃度配比。增殖培養中不同的激素配比對側芽的形成效果不同，激素過少不能促進側芽的形成和生長，激素過多會抑制側芽的形成和生長。增殖培養中的激素組合以細胞分裂素和生長素為主，常用的組合是6-BA和IBA，如雷亞靈[10，12]以MS+6-BA 05mg/L+IBA 03mg/L和S+6-BA 30mg/L+IBA 01mg/L為適宜的增殖培養基；馮潤東等[7]以MS+6-BA 10mg/L+IBA 012mg/L為理想的增殖培養基；而邢合龍等[8]則以MS+6-BA 10mg/L+IBA 01mg/L為最佳增殖培養基。此外，MS+6-BA 10mg/L+IBA 005mg/L[22]、MS+6-BA 10mg/L+IBA 01mg/L[12]都能夠使繡球花的增殖效果明顯。從上述研究可以得出，增殖培養基中添加6-BA的濃度范圍是05-30mg/L，而IBA的濃度則控制在005-03mg/L之間。6-BA配合IBA并不是唯一的最佳組合配比，很多研究的激素組合是以6-BA和NAA為主。姜巍等[4]研究得出不定芽理想的增殖培養基為1/2MS+BA 05mg/L+NAA 01mg/L；段新玲等[23]經篩選，用MS+6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L或MS+6-BA 20mg/L +NAA 02mg/L作為增殖培養基。NAA和6-BA的濃度在一個合理范圍內才有利于增殖的發生，此時不定芽數量多，植株長勢旺盛，苗粗壯，葉色濃綠[15]。NAA和6-BA的濃度不能太高，否則會抑制不定芽的加粗伸長生長，從而使不定芽矮小細弱呈叢生狀態。此外，高濃度的NAA會使不定芽過早地生根[7]。細胞分裂素6-BA配合低濃度的IAA、NAA效果較好，如在MS+6-BA 10mg/L+NAA 02mg/L和MS+6-BA 10mg/L+IAA 01mg/L培養基上，容易形成不定芽，其長勢好，植株健壯[13]，主要原因是在不定芽增殖繼代的培養中隨著6-BA濃度增加，分化率提高，但生長勢減弱，而IAA、NAA在一定范圍內對增殖和伸長的影響不顯著，但濃度過高則會對嫩芽的增殖和伸長產生抑制作用。除了上述涉及的激素以外，還有研究涉及了三種不同種類的激素，在以6-BA 和NAA為主的基礎上附加其他激素。如：MS+6-BA 22mg/L+NAA 01mg/L+GA 05mg/L、MS+6-BA 30mg/L+NAA 01mg/L+GA 05mg/L+活性炭10 g/L、MS+6-BA 30mg/L+NAA 02mg/L+GA 05mg/L+活性碳10g/L，這三種培養基都適宜繡球花的增殖培養[15]；王忠武[16]采用MS+6-BA 05mg/L+NAA 004mg/L+腺嘌呤50mg/L作為增殖培養基也獲得了較高的增殖系數。多數研究中的各種增殖培養基均添加生長素，而殷麗青[14]在繡球花的增殖培養中，適宜的增殖培養基為改良MS+6-BA 10mg/L，并未添加生長素，她認為生長素對繡球花的啟動培養具有一定的促進作用，但對增殖影響不明顯，添加生長素還容易使培養物基部生長根毛，從而影響增殖培養的無菌操作。

4生根培養

瓶內生根和瓶外生根是組培生根培養的兩種方式，而瓶外生根一般是針對生根困難的物種。繡球花的生根培養以瓶內生根的研究占多數。基本培養基則大部分以1/2MS為主，極少用到MS。生根培養基中附加不同種類和濃度的植物生長激素可以使生根更容易，常用的有IBA（濃度為02～10mg/L，以02～03mg/L為主）和NAA（濃度為01～03mg/L），少量用到IAA。任叔輝[13]認為在1/2MS培養基中添加NAA和IBA都能促進根的形成，但隨著濃度的提高，生根率明顯下降，側根生長明顯降低，而其研究結果則以1/2 MS+IBA 01mg/L為最佳生根培養基。在范小峰[9]的研究中，同樣是在1/2 MS培養基上添加IBA，添加濃度為05mg/L，在此濃度范圍內，生根效果最好，生根最早，根數多，生根率達100%，且植株生長粗壯，而當IBA改為IAA時，雖然根較粗壯，但是生根時間慢，生根率較低，最高達909%，可見IAA效果不及IBA，若將兩種生長激素配合使用時，生根率達100%，根數也較多，但根細弱，會影響后期的移栽成活率。韓玉林[21]研究表明4/5MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L有利于組培苗不定根的形成。繡球花瓶外生根的研究近年也有相關報道。龔偉等[3]將組培苗扦插于預先經福爾馬林消毒處理好的瓶外生根基質珍珠巖∶蛭石=1∶1上，在濕度大于85%的條件下進行培養，生根率達100%。吳華芬等[22]采用與龔偉相同的瓶外生根方法，研究結果是相一致的。瓶外生根相對于瓶內生根而言，由于省去了生根培養這一階段，其培養程序得到了簡化，節約了生產時間，同時也降低生產成本，是工廠規模化生產的有效途徑之一。

5煉苗移栽

煉苗移栽是組織培養的最后一個階段，煉苗的常規做法是：先將組培苗置于室外自然條件下煉苗2～3d，目的是使其適應外部的環境條件，有利于之后的移栽，然后取出洗凈基部培養基，并用一定濃度的殺菌劑進行組培苗的殺菌，即可移栽到基質上。移栽后的工作主要是環境溫濕度的控制，以及土壤的水肥管理。

大多數組培苗的相關研究主要圍繞移栽基質的種類和配比進行。所用移栽基質的主要成分有河沙、珍珠巖、蛭石、泥炭等。移入河沙中，成活率達95%[20]。移入珍珠巖∶腐殖土=1∶2，成活率達80%以上[12]。移栽到珍珠巖∶蛭石=1∶1，成活率為896%（龔偉等，2003）。在珍珠巖∶蛭石=1∶2基質上，成活率可達100%[10]。采用基質蛭石∶珍珠巖=1∶1也可保證移栽的成活[16]。采用營養土配方為腐殖土、珍珠巖、有機肥體積比為3∶2∶1，成活率可達98%，且長勢良好[9]。姜巍等[4]將組培苗進行煉苗后，再分別移栽到6種不同的基質，結果表明爐灰渣、1/2珍珠巖+1/2蛭石兩種基質中效果最佳，成活率分別為975%、950%，但從移栽基質的來源與試管苗的長勢看，爐灰渣好于1/2珍珠巖+1/2蛭石。

6討論與展望

繡球花用途廣，觀賞價值高，既可做園林綠化又可做盆花切花，是著名的觀賞花卉。繡球花具有多元化的色彩，這個特點非常符合我國彩色苗木產業發展的需求。我國的繡球花組織培養研究起步較晚，通過多年的努力，現已逐漸取得了一定進展，并逐步建立了一套繡球花快速繁殖的體系。目前主要存在以下幾個問題：外植體的類型比較單一，僅局限于莖葉；不定芽的分化率低，尤其是以葉片為外植體，通過葉片產生愈傷從而誘導分化不定芽的愈傷分化率較低。今后的研究應該在多方面開展，例如多以繡球花葉片為外植體的高效再生途徑，為繡球花高效遺傳轉化體系的建立奠定基礎，以及今后的基因工程選育優良園林品種提供技術參考。

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