基于質譜的蛋白質組學技術在系統性紅斑狼瘡中的應用

吳碧濤，蔣文強 （綿陽市中心醫院檢驗科，四川 綿陽 621000）

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，其病因不明，臨床表現復雜，診斷困難，治療受限。蛋白質組學研究通過差異蛋白篩選，可發現隱藏于疾病背后的確切病理機制，找到新的、更加敏感而特異的生物標志物，提供藥物治療新靶點。本文僅就基于質譜的蛋白質組學技術在系統性紅斑狼瘡患者血液、尿液、唾液等體液檢測中的應用作一簡單綜述。

1 系統性紅斑狼瘡

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的慢性自身免疫性炎癥性結締組織疾病，起病隱匿，臨床表現多樣，常表現為復發加重與緩解交替進行的病程。可侵犯大多數的組織器官，包括心、腦、皮膚、關節和腎臟等［1］。值得注意的是，該病多發于育齡期女性，男女患病比例約為1∶9，且在白種人中發病率更高［2］。血清中出現高滴度的以抗核抗體為主的自身抗體為該病的又一特點，這些抗體沉積于組織，形成免疫復合物，激活免疫系統，最終導致組織器官損傷［3］。盡管對SLE的研究已較深入，但其卻確的病因學及病理機制還知之甚少。普遍認為，基因、表觀遺傳、環境、性激素、免疫調節等因素，以及它們彼此之間的相互作用，均參與了SLE的發病［1］。目前，對SLE的明確診斷仍比較困難，患者需符合由美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）提出的11項臨床及實驗室診斷標準中的至少4項方能被診斷為SLE患者［4-5］。然而，這些標準只適用于對患者的分類，對于僅有早期征兆的患者可能漏診。來自第三方實驗的數據顯示僅有60%的SLE患者滿足ACR標準［6］。盡管將激素和免疫抑制劑用于SLE治療后，其預后得到了很大改善，但目前尚無徹底根治辦法。基于SLE病因不明，臨床表現復雜，診斷困難，治療受限，因此迫切需要發現隱藏于疾病背后的確切病理機制，找到新的、更加敏感而特異的生物標志物，發現藥物治療新靶點［7］。

2 蛋白質組學

蛋白質組學是繼基因組學、轉錄組學之后，生命科學前沿及熱點研究領域的重要代表之一［8-11］。1994年澳大利亞Macquarie大學的科學家Wilkins等首次提出蛋白質組（proteome）的概念［12］，是指一個基因組、細胞或組織表達的所有蛋白質［13］，也可說是指細胞或機體全部蛋白質的存在及其活動變化規律。而研究細胞內全部蛋白質的組成及其活動規律的科學被稱為蛋白質組學（proteomics）。它以蛋白質組為研究對象，在整體水平上研究存在于細胞、組織或生物體內的所有蛋白質，包括蛋白質的組成、表達水平、結構、翻譯后加工修飾、生物功能以及蛋白質之間的相互作用及其變化規律等。據此，蛋白質組學研究內容可分為：表達蛋白質組學、結構蛋白質組學、比較蛋白質組學以及功能蛋白質組學［14］。研究蛋白質組學的常用技術包括蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術、生物信息學技術以及相對和絕對定量同位素標記技術等［15］。蛋白質分離技術主要包括雙向凝膠電泳（2-DE）、雙向熒光差異電泳以及液相色譜（LC）等技術。目前最普遍采用的蛋白質鑒定技術是質譜分析技術。

3 生物質譜

質譜在蛋白質組學的研究中起著至關重要的作用，是最關鍵的蛋白鑒定技術。質譜技術是指通過質譜分析儀鑒定經過各種途徑分離的蛋白質，其基本原理是樣品經離子化后，據不同離子的質荷比（m／z）來分離鑒定樣品的相對分子質量［16］。質譜儀由進樣器、離子源、質量分析器、離子檢測器和分析系統五部分組成。其核心部分包括：離子源、質量分析器和離子檢測器［17］。按質量分析器種類不同質譜儀可分為不同的類型，如：飛行時間質譜（time of flight mass spectrometry，TOF-MS）、表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（surface enhanced laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）、傅里葉變換離子回旋共振質譜（Fourier-transform mass spectrometry，FT-MS）、線性離子阱質譜（Linear ion traps in mass spectrometry，LIT）、四級桿離子阱質譜儀（quatrupole ion trap mass spectrometry）以及 Obitrap等［18］。目前常用的質譜包括基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧離子化質譜（ESI-MS）。MALDI（前者）利用激光脈沖從干燥結晶的基質中氣化被分析物并使之帶電，常用于分析高分子量的蛋白，測定的是肽質量指紋比對；ESI（后者）常與液相分離工具相連，將被分析物從溶液中離子化，檢測靈敏度更高，可達飛克級水平，測定的是肽碎片指紋比對［16，19-21］。

4 基于質譜的蛋白質組學技術在SLE中的應用

4.1 SLE患者血液（血清及PBMC）蛋白質組學研究：血清和外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）可以被容易且無侵襲性地獲取。兩種基質都能對來自機體不同的信號，如炎癥狀態，做出快速的反應［22］。盡管近年來在有關SLE的研究中，外周血單個核細胞被廣泛關注［22，23-29］，血清仍是最廣泛應用的血液成分。Pinna S等利用差異蛋白質組學分析提示幾種蛋白質在SLE患者的PBMC中被異常表達［22］。在這些蛋白之中，PRDX2可能被用于候選生物標志物或進一步研究的靶蛋白。同時在血清中，他們發現與健康對照者相比，SLE組血清聚集蛋白水平升高了，但這個升高并無統計學意義。Φstergaard O等使用胰蛋白酶消化后，將循環微粒（circulating microparticles，MP蛋白）通過LC-MS鑒定并定量，結果發現：與對照組系統性硬化癥患者和健康志愿者相比，在SLE患者血清組找到具有差異的MP蛋白超過1 000種，并發現SLE-MPs（被建議稱為Luposomes）亞群對于SLE具有高度特異性［30］。在SLE-MPs中，血小板蛋白和線粒體蛋白顯著減少，細胞骨架蛋白紊亂，而糖酵解酶和凋亡蛋白顯著增加。在Kazemipour N及其團隊［31］的研究中，實驗被分為SLE組與健康對照者組，各組血清中的高豐度蛋白通過使用一種特殊的試劑盒去除后，繼之用2-DE和MALDI-TOF／TOF-MS分離鑒定血清蛋白，結果在試驗組找到15個差異表達的蛋白點，包括7種上調和8種下調的蛋白。這些蛋白點經進一步鑒定后被歸類為3組，包括角蛋白、載脂蛋白和白蛋白以及單獨的蛋白質，如轉甲狀腺素蛋白、觸珠蛋白和凝血酶原。

4.2 SLE患者尿液蛋白質組學研究：狼瘡腎炎（Lupus nephritis，LN）是系統性紅斑狼瘡最常見且嚴重的并發癥，也是導致SLE患者死亡的主要原因之一［32］。高達50%的SLE成人患者在疾病早期即有腎臟受累的征兆或者最終導致明顯的腎臟疾病［33］。目前，傳統的用于檢測和評估狼瘡腎炎的實驗室標志物包括蛋白尿、尿蛋白／肌酐比值、肌酐清除率、抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體、補體水平等［34］，但由于它們或者特異性不高，或者敏感性不夠，其臨床應用效果并不令人滿意。盡管腎臟活檢仍然是診斷和分類腎臟炎癥和瘢痕程度的金標準［34］，由于該方法為有創性的檢查，其操作具有風險性以及給患者帶來不適，因此利用蛋白質組學的方法研究狼瘡腎炎患者尿液被大力推廣。一方面，尿液標本容易獲取，可反復、連續獲得；另一方面，尿液直接來源于狼瘡腎炎的受累組織。因此，相較于血液標本，在狼瘡腎炎患者的體液標本中，尿液顯示出更廣闊的應用前景。Wei R等［33］采用GC-MS的方法對比研究了狼瘡腎炎、非腎炎性SLE以及健康對照者的尿液蛋白質組學，他們的試驗發現與非腎炎性SLE患者組相比，狼瘡腎炎組有70種膠原蛋白肽顯著改變，與健康對照組比，狼瘡腎炎組有230種膠原蛋白肽顯著改變，這些差異蛋白被定義為“狼瘡腎炎膠原蛋白肽”。Aggarwal A及其研究團隊［35］根據SLE疾病活動度指數將患者分為活動性腎炎患者（AR）、活動性非腎炎患者（ANR）或非活動性組（ID），將來自各組的患者尿液蛋白通過2-DE分離，繼之用MALDI-TOF-MS／MS方法鑒定。篩選出的生物標志物用ELISA的方法驗證。結果發現：尿液蛋白 alpha-1 anti-chymotrypsin（ACT），haptoglobin（HAP）以及retinol binding protein（RBP）在活動性腎炎患者組被檢測到，而非活動性組未檢測到。Somparn P等用ESI-Q-TOF MS／MS的方法研究狼瘡腎炎潛在的生物標志物，在所有升高的蛋白中，Prostaglandin H2D-isomerase（PGDS）成為了感興趣的標志物［36］。PGDS催化PGH2的異構化產生Prostaglandin D2（PGD2），PGD2參與血小板聚集、過敏、炎性反應以及化學趨化作用。他們的研究結果顯示：與非LN腎小球疾病和健康對照組相比，成年人及兒童活動性LN患者尿液PGDS表現出顯著的升高。

4.3 SLE患者唾液蛋白質組學研究：研究發現，大約10%～20%的系統性紅斑狼瘡患者是在他們生命的前10年被首次診斷為該病［37］。該病鮮有在5歲之前發病，出現臨床癥狀的平均年齡是12.1歲［38-40］。在臨床表現、免疫學改變及治療方法方面成年人與兒童系統性紅斑狼瘡并無明顯不同，但比起成年人，兒童患者通常經歷更高的疾病活動度以及進展性更強的疾病過程［41-42］。報道稱，在兒科疾病中，自身免疫性風濕性疾病是最常見的發病和死亡原因。考慮到在兒童患者中該病較高的發病率以及死亡率，其早期診斷就顯得尤為重要。傳統地，患者血清中系統性紅斑狼瘡相關自身抗體檢測扮演了非常重要的角色。然而，由于血液采樣可能給患者帶來不適，尤其是兒童，因此，新的侵入性更小的，甚至非侵入性的技術或方法對于兒科患者就顯得尤為重要。從這個角度出發，唾液樣本具有許多優勢，如易獲得性、快速收集、采樣過程無痛苦無風險等。最新研究顯示，唾液成分的變化與機體病理生理狀態密切相關，被視為“人體健康狀態的窗口”。唾液被認為是一個潛在的生物標志物儲存庫［43］。分析唾液成分變化可有效反應機體生理和病理狀態。在這一背景下，系統性紅斑狼瘡患者唾液蛋白質組學研究顯示出了誘人的前景。盡管至目前為止，該領域的研究數量有限，但相信隨著研究的深入，更多的關于唾液蛋白質組學用于系統性紅斑狼瘡的研究成果將會被陸續報道。

5 總結與展望

近年來，蛋白質組學知識和技術的出現為研究自身免疫性疾病提供了新的視角。系統性紅斑狼瘡是自身免疫性疾病的重要代表。以其高通量、高敏感性及高特異性為特點，蛋白質組學技術被廣泛應用于系統性紅斑狼瘡疾病的相關研究中，包括闡明其病理生理機制，輔助疾病早期診斷，尋找新的診斷用生物標志物以及發現可能的藥物作用靶標。我們相信，這些研究將有助于進一步提高系統性紅斑狼瘡疾病的診斷及治療水平。

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