不同固定液在細胞蠟塊技術中的應用

王敏，虞繼紅，賀吉，余波

脫落細胞學檢查是病理診斷常規方法之一，常規的細胞學涂片常因細胞量少、細胞發生變性及涂片厚薄不均等因素影響，導致細胞學診斷的陽性率較低，易發生漏診；且僅根據涂片上有限的腫瘤細胞，不易判斷腫瘤細胞的來源，也無法進行一些后續的檢測手段，如免疫組化及基因檢測等。然而將臨床上最常見的脫落細胞學檢查標本胸腹水制作成細胞蠟塊，可明顯提高細胞病理診斷的敏感性和特異性，而且對于部分獲取病理組織困難者意義較大。細胞蠟塊制作方法多種，所用固定液也多種，為尋找制作細胞蠟塊最佳的固定液，本文采用3種病理科常用的固定液，對同一細胞涂片陽性的漿膜腔液體進行細胞蠟塊制作，發現12%中性甲醛固定效果最佳。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 收集2018年1—6月寧波市北侖區人民醫院病理科腫瘤性胸腹水10例，細胞學涂片診斷明確見到癌細胞。按需要選擇 CK（pan）、CK7、CEA、TTF-1、p63、CD56及Syn等抗體，一抗試劑為福州邁新公司，二抗及顯色液為DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞蠟塊制備方法 （1）臨床送檢新鮮胸腹水，通過常規細胞學涂片診斷見到癌細胞的病例，用標1、2、3三個50m l尖底離心管各取約40 m l胸水，離心速度3 000 r/m in，離心10 m in，棄上清，若細胞量過少，可以采取多次離心棄上清，保留沉淀物。若胸腹水為血性標本，建議用冰醋酸酒精液（25m l酒精+10m l冰醋酸+65 m l水）去除紅細胞；具體操作方法如下：先將胸腹水置于離心管中進行首次離心，棄去上清，再將冰醋酸酒精液置入離心管中，混勻，進行再次離心，棄上清，隨后向離心管中加入相應的固定液。（2）1管加入12%中性甲醛、2管加入95%乙醇、3管中加入甲醇各10 m l。（3）震蕩，靜置1h左右，再離心，棄上清。（4）用吸管將離心管底部的細胞吸取到顯微鏡擦鏡紙上，包好，放入盛有12%中性甲醛標本盒中1 h，與常規組織取材后，一起放入自動脫水機中進行組織處理，待組織處理結束，取出組織塊，進行常規石蠟包埋，制作成細胞蠟塊。

1.2.2 切片與烤片 將細胞蠟塊放入冰箱冷凍室放置5～10 min，進行常規切片數張，切片厚度為4 m，置入65℃烤箱烤片1.5 h。

1.2.3 HE染色和免疫組織化學染色一張切片進行常規HE染色，其余數張切片根據不同需要進行相應的免疫組織化學抗體染色，根據一抗需要選擇不同的修復液，按照一抗及二抗試劑說明書進行EnVision染色法，DAB顯色完成后進行蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 顯微鏡下觀察HE切片結果 采用12%中性甲醛固定的細胞塊，細胞排列方式明顯可見，細胞形態完好，細胞輪廓清晰，胞核明顯可見，腫瘤細胞與周圍正常間皮細胞、組織細胞形態學形成鮮明對比，異型腫瘤細胞核仁較明顯，背景干凈，染色鮮艷（封四彩圖6）；采用95%乙醇、甲醇固定的HE切片染色效果相似，細胞排列方式不易辨認，細胞形態稍有退變，細胞輪廓欠清晰，胞漿淡染，空泡化明顯，核保存欠佳，部分核體積增大，部分核固縮，染色不鮮艷（封四彩圖7）。

2.2 免疫組化標記結果 3種固定液固定的漿膜腔積液在相同腫瘤中均呈陽性，但12%中性甲醛固定的細胞蠟塊的免疫標記染色效果最好，標記清晰，背景干凈（封四彩圖8～9）；95%乙醇、甲醇固定液固定的細胞蠟塊免疫標記染色效果欠佳，標記稍減弱（封四彩圖10～11）。

3 討論

目前針對臨床上送檢的漿膜腔積液，處理方法通常為2種，一種是采用細胞學涂片，其缺點是細胞采集量少，且涂片易厚薄不均，制片質量與人員的技術水平關系密切，易受多種因素影響，從而影響病理診斷；另一種是采用液基細胞學制片技術，此方法改善了細胞學制片質量，但標本失去了細胞排列方式和背景細胞，對可疑和高分化癌細胞以及反應性間皮細胞和間皮瘤不易鑒別[1]，且成本較高，檢查費用昂貴，在許多小型醫院無法開展。而細胞蠟塊技術的應用，使細胞有組織學形態，保存了細胞的排列方式，且細胞蠟塊可進行多次切片，用于其他多種項目的檢測，如特殊染色，免疫組織化學染色等，進一步提高了細胞學診斷的陽性率，還可以判斷細胞的來源、分型及評估患者預后[2]。

臨床上細胞蠟塊制作方法有多種[3-4]，但是對于不同固定液對漿膜腔積液制作細胞蠟塊效果影響的文章較少見。本文應用臨床上最常見的3種固定液（12%中性甲醛，95%乙醇、甲醇）對漿膜腔積液細胞制作為細胞蠟塊時進行固定，觀察此3種固定液對細胞蠟塊HE染色及免疫組織化學染色效果的影響.實驗結果得出12%中性甲醛固定液的固定效果最好，HE染色鮮艷，細胞形態完好，免疫組織化學染色結果清晰，易判；而95%乙醇和甲醇的固定效果欠佳，HE染色顏色不鮮艷，細胞形態發生改變，細胞空泡化明顯，部分核固縮，部分核體積增大，免疫組織化學染色抗體標記減弱，部分抗原丟失。

在制作細胞蠟塊過程中，采用12%中性甲醛固定離心后，細胞不易凝結在一起，不利于包埋，此時盡可能將試管中的液體取出，用吸管將細胞沉淀物吸出，置于玻片上，周圍液體用濾紙吸干，向細胞沉淀物上滴上幾滴95%乙醇，細胞沉淀凝固成塊，易制作成細胞蠟塊。95%乙醇與甲醇兩者固定較迅速，細胞容易結成塊，利于細胞蠟塊制作。

綜上所述，本文通過比較病理科常用的3種固定液在細胞塊制作技術中的效果，得出12%中性甲醛效果最佳，不僅完好的保存了細胞形態，而且對抗原影響較小，得到了較滿意的細胞蠟塊HE和免疫組化染色結果，因此采用12%中性甲醛制作細胞蠟塊的技術值得推廣。