PPARα與自發性高血壓大鼠主動脈重構的關系研究

胡文杰 陳 鵬

1 寧夏中衛市人民醫院心血管內科 755000； 2 寧夏回族自治區人民醫院急診科

原發性高血壓病（Essential hypertension，EH）是一種多基因遺傳與環境因素交互作用而產生的以動脈血壓升高為特征的全身性疾病［1］。長期的血壓升高，動脈血管壁因受到壓力作用而發生的結構和功能的改變，導致相應動脈發生血管重構［2］（Vascular remodeling，VR）。VR既是高血壓的病理變化，又是高血壓維持和加劇的結構基礎，其發生機制尚不明確。本研究探討自發性高血壓大鼠主動脈VR存在時，其過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome pro1iferator activated receptorsα，PPARα）的表達狀況，為進一步明確高血壓狀態下VR的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 雄性16周齡自發性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR）10只用于實驗（SHR組），雄性16周齡wistar大鼠（WKY組）10只作為對照組，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。所有大鼠均飼養于SP－F級環境中，安靜、正常光照、自由飲食，飲用冷開水。

1.2 儀器試劑 BL－420E＋生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；YP601電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。單克隆兔抗PPARα抗體購自Santa Cruz公司，單克隆兔抗GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 大鼠無創血壓測定 大鼠在實驗開始（16周齡各組5只）和實驗結束（24周齡各組5只）時，清醒安靜狀態下，使用BL－420E＋生物機能實驗系統測定尾動脈壓收縮壓（SBP）值。

1.4 組織標本處理 實驗大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉后處死，處死后迅速取出胸主動脈，吸干殘血，置于4℃預冷的4%中性多聚甲醛溶液中固定48h，常規石蠟包埋，備用于組織學檢查；腹主動脈裝入凍存管中、標記，投入液氮中迅速冷凍后移置于－80℃冰箱中冷凍，備用于Western blot蛋白含量測定。

1.5 主動脈組織學觀察及彈性纖維染色 主動脈垂直立于蠟塊托包埋，切片厚度2μm，每個蠟塊連續切片5張行HE染色，以便進行組織學觀察；每張主動脈切片隨機計數10個高倍視野中的血管平滑肌細胞（VSMC）數量，并求平均值；醛品紅法進行彈性纖維染色，觀察主動脈中層彈力膜的重排情況，按照流程配試劑及染色，彈性纖維為藍紫色，背景細胞為淡藍色。

1.6 Western－blot檢測 按照蛋白質SDS－PAGE電泳操作步驟進行配膠、電泳、DAB染色及采集圖像。檢測結果結果經Bio－Rad Co.生物醫學圖像分析系統，對目的條帶進行掃描和密度分析。

1.7 統計分析 SPSS12.0Mann－Whitney u檢驗或Student’s t檢驗用來確定結果的統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血壓變化 實驗期間大鼠飲食、活動正常，無死亡，SHR大鼠體重明顯低于相同周齡WKY大鼠，16周齡和24周齡SHR大鼠的SBP值分別高于同周齡的WKY大鼠，24周齡SHR大鼠血壓明顯高于16周齡組，WKY大鼠血壓隨周齡變化不明顯（表1）。

表1 實驗大鼠體重和SBP(±s，n＝5）

表1 實驗大鼠體重和SBP(±s，n＝5）

注：＊為SHR與同周齡WKY比較，P＜0.05。

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2.2 SHR大鼠主動脈重構 實驗大鼠主動脈內膜光滑、管壁厚度較均勻；HE染色可見WKY大鼠主動脈中膜VSMC排列均勻有序，16周齡SHR大鼠主動脈VSMC出現疏密不均，24周齡時VSMC排列更為紊亂；與同周齡WKY組比較，16周齡SHR組主動脈VSMC數目沒有明顯變化，24周齡SHR組的主動脈VSMC數目較多（表2）；醛品紅法彈性纖維染色可見，16、24周齡WKY大鼠主動脈中層彈性膜分層清晰、完整，16周齡主動脈彈性膜排列紊亂，SHR24周齡SHR出現彈性膜松散、斷裂、厚薄不均（圖1）。

2.3 主動脈PPARαWestern blot檢測結果PPARα蛋白相對分子量為52KDa，蛋白相對表達量由Western Blot條帶相對灰度值確定，Student’s t檢驗用來確定實驗結果的統計學意義（＊代表P＜0.05；＃代表P＜0.01）。結果顯示：16、24周齡SHR大鼠主動脈PPARα蛋白表達水平分別高于同周齡WKY大鼠，16周齡SHR的表達量明顯高于16周齡WKY大鼠，24周齡大鼠主動脈PPARα蛋白表達高于16周齡（圖2）。

圖1 主動脈血管重構的形態為改變

注：a～b：HE染色100×，a：WYK16、b：SHR16、c：WKY24、d：SHR24，WKY組VSMC均均有序，SHR組VSMC疏密不均；e～h：彈性纖維染色100×，e：WKY16、F：SHR16、G：WKY24、h：SHR24，WKY組彈性膜完整清晰，SHR組彈性膜排列紊亂。

圖2 Western blot檢測主動脈PPARα蛋白表達水平

表2 實驗大鼠主動脈中膜VSMC總數（個／10HPF）

3 討論

動脈VR是高血壓維持和惡性循環的結構基礎。研究顯示，高血壓時大動脈呈現管壁中層彈力膜內VSMC排列紊亂，纖維基質與VSMC結合松散；彈性膜斷裂、彈性纖維數量減少等VR的形態學特征［5］。筆者應用自發性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR）為研究對象，為了模仿人類高血壓的成年和老年時期，選擇16周齡和24周齡SHR大鼠［3，4］，對比觀察SHR大鼠和WKY大鼠主動脈的不同形態學特征。

筆者首先通過HE染色計數實驗大鼠主動脈VSMC的數目，結果顯示，24周齡SHR組的主動脈VSMC數目高于同周齡WKY組；16周齡SHR組主動脈VSMC數目與同周齡WKY組比較沒有明顯增多，這可能提示16周齡SHR主動脈VR以血管壁彈力膜病變為主，VSMC不出現明顯增殖。通過彈性纖維染色觀察到，SHR大鼠VSMC排列疏密不均；16周齡SHR主動脈彈性膜排列紊亂，24周齡時彈性膜出現松散、斷裂、厚薄不均，因此推斷，這些結構改變能夠促進高血壓狀態下主動脈管腔擴張、順應性減退。

研究證實高血壓引起的血管重構可能與PPARα的異常表達有關［6，7］。PPARα是核激素受體家族成員，是維持能量平衡、催化和調節多種生化反應的關鍵轉錄因子，在心血管系統廣泛表達，存在于血管內皮細胞、VSMC、單核巨噬細胞和心臟組織，具有調節細胞生長、遷移、氧化應激和炎性反應的作 用［8，9］。Diep QN等［10］首 次 證 實16周 齡SHR大鼠主動脈中PPARα無論是在蛋白水平還是在mRNA水平，其表達量明顯高于16周齡WKY大鼠；而將主動脈VSMC原代培養后，這些VSMC中檢測不到PPARα蛋白的表達，而且mRNA水平很低，結合本文結果：16周齡SHR主動脈PPARα蛋白表達水平明顯高于16周齡WKY大鼠，但其主動脈VSMC未出現明顯增殖，筆者推測SHR大鼠主動脈PPARα高表達狀態與單純VSMC的變化無明顯相關，與其結構改變有關。

同時，通過對24周齡SHR組的主動脈觀察可見，VSMC數目明顯高于同周齡WKY大鼠，但PPARα蛋白表達量增高的幅度并不明顯，因此進一步證實，PPARα的蛋白表達水平增高是高血壓主動脈VR的重要原因。

另外，24周齡WKY大鼠主動脈PPARα蛋白表達量明顯高于16周齡WKY大鼠，筆者推測，PPARα高表達可能也是老年人易患高血壓的重要原因。

原發 性 高 血 壓 的 發 生 機 制 復 雜［11～14］，PPARα在大動脈VR的形成和發展中發揮了重要作用，筆者未來將深入研究PPARα在該過程中的調控機制，為臨床防治高血壓血管病變奠定實驗基礎。

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