Septin-9在ALL病兒骨髓組織中的表達及意義

(1 鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)血液內科，湖北 黃石 435000； 2 武漢市協和醫院血液內科)

急性淋巴細胞白血病(ALL)作為一種兒童時期常見的血液系統惡性腫瘤，是由于骨髓中的原始幼稚細胞發生克隆性異常增殖并抑制正常造血功能導致的，嚴重威脅兒童生命健康[1-2]。目前，隨著臨床上ALL化療技術的不斷進展，多數病兒預后比較良好，但是仍有20%～30%的病兒化療后會出現復發[3-5]，而復發病兒再次化療緩解率較低，預后不佳[6]。因此，積極探討影響ALL復發的相關機制對改善病兒預后具有重要意義。胞裂蛋白(Septin)作為一種進化上高度保守的具有GTPase活性的基因家族，廣泛存在于真核生物體內，在細胞分裂、細胞周期調控、細胞內物質轉運、細胞凋亡等多種生物學功能中發揮重要作用[7]。Septin-9是Septin家族的重要成員，有研究表明，Septin-9參與了多種惡性腫瘤惡性化過程，且與腫瘤復發密切相關[8]。本研究擬觀察ALL病兒骨髓組織中Septin-9表達的變化，并分析Septin-9表達變化對ALL細胞增殖和侵襲力的影響，以探討其在兒童ALL發病機制中的作用，并為臨床上的靶向治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月—2017年8月在我院門診就診或住院治療的ALL病兒共94例，其中初診病兒63例，男37例，女26例，年齡1.4～14.2歲，平均(6.4±2.8)歲；包括急性B系淋巴細胞白血病(B-ALL)44例和急性T系淋巴細胞白血病(T-ALL)19例；根據中國兒童血液病研究組2008方案組(CCLG-08組)分組標準分為標危組17例，中危組22例，高危組24例。緩解病兒20例，男11例，女9例，年齡2.5～13.4歲，平均(7.7±3.6)歲。復發病兒11例，其中男7例，女4例，年齡1.8～14.5歲，平均(7.7±4.3)歲。另選取同時期進行骨骼矯治手術的病兒16例作為對照組，其中男9例，女7例，年齡2.7～12.8歲，平均(7.2±3.1)歲；均排除血液系統疾病及其他惡性腫瘤。各組病兒性別、年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。

1.2 主要試劑和設備

淋巴細胞分離液購自中科院生物醫學工程研究所；人Jurkat細胞系購自上海中喬新舟生物科技公司；RPMI 1640培養基、體積分數為0.10胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Trizol總RNA提取試劑盒和Lipofectamine 2000轉染液購自美國Invitrogen公司；逆轉錄和PCR擴增試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；Septin-9和內參序列由上海生工生物工程有限公司設計合成；Septin-9干擾序列和陰性對照序列由上海吉瑪制藥技術公司設計合成；兔抗人Septin-9多克隆抗體購買自美國Santa Cruz公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)液和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒購買于南京凱基生物科技發展公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購買于美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠電泳分析系統購買于日本Kodark公司。

1.3 方法

1.3.1標本采集 所有研究對象均抽取新鮮骨髓樣品2～5 mL，肝素抗凝，加入淋巴細胞分離液；用離心機2 000 r/min離心25 min，留取界面層單個核細胞，PBS沖洗2次，計數并分裝于無菌離心管內，于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3.2實時熒光定量PCR技術檢測單個核細胞中Septin-9 mRNA表達 按照Trizol總RNA提取試劑盒說明完成操作，提取單個核細胞中總RNA，利用BIO分光光度計對總RNA純度和濃度進行檢測，以A260/A280在1.80～2.20且濃度≥200 mg/L為合格。按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為單鏈cDNA，以cDNA為模板，按照PCR試劑盒進行熒光定量PCR擴增。引物序列如下。Septin-9上游引物：5′-CCAAGTGACCAGGGAAGTGT-3′，下游引物：5′-AAGGCACGGGTAGATCAACAG-3′，GAPDH上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAG-ACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAA-TCC-3′。PCR反應條件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s，循環38次，每個樣品設3個平行復孔。用2-△△Ct法計算單個核細胞中Septin-9 mRNA的相對表達量。

1.3.3細胞培養和處理 將Jurkat細胞用含體積分數為0.01胎牛血清的RPMI 1640培養基培養，于37 ℃、飽和濕度、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養。24 h后胰酶消化，傳代培養。取對數生長期的細胞，接種于24孔板中，細胞濃度2×108個/L。用Lipofectamine 2 000轉染液對細胞進行分組轉染：①Septin-9干擾組(C組)：轉染Septin-9小分子RNA干擾序列，正義鏈：5′-AGGCGUACCGUG-UGAAGCGCCUCAA-3′，反義鏈：5′-UUGAGGC-GCUUCACACGGUACGCCU-3′；②陰性對照組(B組)：轉染陰性對照序列，正義鏈：5′-TTTGCGCTC-TTCGGATCTTTAGCTCTTGATATCCGGAGCT-AAAGATCCGAAGAGTTTTTT-3′，反義鏈：5′-C-TAGAAAAAACTCTTCGGATCTTTAGCTCCG-GATATCAAGAGCTAAAGATCCGAAGAGCG-3′；③空白組(A組)：不作任何處理。各組細胞轉染完成后恒溫培養48 h，完成后續實驗。

1.3.4Western blot方法檢測各組細胞中Septin-9蛋白表達 取轉染后培養48 h細胞，用細胞裂解液裂解，用總蛋白提取試劑盒提取細胞中總蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白進行定量檢測。行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，將膜在含有50 g/L脫脂奶粉的PBS中封閉60 min。加入一抗(稀釋比例1∶800)，4 ℃孵育過夜；洗膜3次，加入二抗，室溫孵育120 min；洗膜3次，暗室下用化學發光試劑顯影、定影。以GAPDH為內參照，采用Image J圖像分析軟件進行分析，以獲得目的蛋白條帶相對表達量。

1.3.5MTT法檢測細胞增殖能力 取各組細胞，胰酶消化，制備單細胞懸液，密度為5×109個/L。取200 μL單細胞懸液接種于96孔板中，每組設6個復孔，恒溫培養，于37 ℃、飽和濕度、含體積分數0.05的 CO2培養箱中培養。分別于培養24、48、72、96 h時，向各孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，繼續培養4 h，棄培養液，各孔加入DMSO液150 μL，充分振蕩15 min，采用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度A值。

1.3.6流式細胞術檢測各組細胞周期 取各組轉染后培養48 h細胞，預冷PBS沖洗3次，室溫下1 000 r/min離心6 min；棄上清液，4 ℃下用冰乙醇過夜固定；室溫下1 000 r/min離心6 min，棄乙醇，PBS沖洗2次。根據試劑盒說明操作，加入RNase A，室溫下靜置1 h，后以1 000 r/min離心6 min；棄上清液，加入碘化丙啶(PI)500 μL，避光反應0.5 h；上機檢測2×104個細胞，用CellQuest軟件對細胞周期進行分析。

1.3.7劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取各組細胞，胰酶消化，離心留取細胞沉淀，按5×104/孔細胞接種于6孔板。待細胞鋪滿皿底后，用移液槍槍頭垂直于孔板盡量畫直線，用PBS沖洗3次，加入不含血清的培養液，恒溫培養，于37 ℃、飽和濕度、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養。分別于0、24和48 h時拍照，計算劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h/48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。重復實驗3次。

1.3.8Transwell小室檢測細胞侵襲能力 將Matrigel基質膠稀釋后平鋪于Transwell上室，4 ℃風干備用。取各組細胞，胰酶消化，離心留取細胞沉淀，用無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度為1×109個/L。取200 μL細胞懸液加入小室上室，將500 μL含體積分數為0.10胎牛血清的培養液加入小室下室，置于37 ℃、飽和濕度、含體積分數0.05的CO2培養箱中進行培養。24 h后，將小室取出，以40 g/L的甲醛固定，結晶紫染色，PBS沖洗3次，用棉簽輕輕將散落的細胞去除，顯微鏡下觀察并計算穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 初診病兒骨髓單個核細胞中Septin-9表達

初診病兒骨髓單個核細胞中Septin-9 mRNA的相對表達量為1.77±0.33，高于對照組的1.15±0.11，差異有統計學意義(t=7.283，P<0.05)；初診病兒中，B-ALL和T-ALL病兒骨髓單個核細胞中Septin-9 mRNA相對表達量分別為1.74±0.34和1.82±0.29，差異無顯著統計學意義(t=0.812，P>0.05)。標危組、中危組和高危組病兒骨髓單個核細胞中Septin-9 mRNA的相對表達量分別為1.42±0.17、1.72±0.14和2.05±0.21，組間比較差異均有統計學意義(F=108.770，P<0.05)。

2.2 不同病程病兒骨髓單個核細胞中Septin-9的表達

初診病兒、緩解病兒和復發病兒骨髓單個核細胞中Septin-9 mRNA的相對表達量分別為1.77±0.33、1.37±0.07和2.26±0.16，各組間比較差異均有統計學意義(F=51.456，P<0.05)。

2.3 各組細胞中Septin-9蛋白表達

C、B和A組細胞中Septin-9蛋白相對表達量分別為0.31±0.06、0.75±0.11和0.86±0.10，差異有統計學意義(F=62.232，P<0.05)；B組和A組細胞中Septin-9蛋白相對表達量比較差異無顯著性(t=1.846，P>0.05)；C組細胞中Septin-9蛋白的相對表達量低于B、A組，差異具有統計學意義(t=8.719、12.159，P<0.05)。見圖1。

A：A組；B：B組；C：C組。

2.4 各組細胞增殖能力比較

C、B和A組24、48、72和96 h細胞增殖能力比較，差異具有統計學意義(F=7.349～32.761，P<0.05)；B組和A組24、48、72和96 h細胞增殖能力比較，差異無統計學意義(P>0.05)，C組24、48、72和96 h細胞增殖能力低于B、A組，差異有統計學意義(t=2.842～48.371，P<0.05)。見表1。

2.5 各組細胞周期的變化

C、B和A組G0/G1期和S期細胞比例比較差異均具有顯著性(F=7.887、8.148，P<0.05)；B組和A組G0/G1期和S期細胞比例比較差異無顯著性(t=0.365、0.874，P>0.05)；C組G0/G1期細胞比例高于B組和A組，而S期細胞比例低于B組和A組，差異具有顯著統計學意義(t=3.112～4.157，P<0.05)；C、B和A組G2/M期細胞比例比較差異無顯著性(F=0.785，P>0.05)。見表2、圖2。

表1 各組細胞增殖能力比較

表2 各組細胞周期變化

2.6 各組細胞遷移和侵襲能力

劃痕實驗結果顯示，C、B和A組24和48 h劃痕愈合率比較差異具有顯著性(F=42.444、97.442，P<0.05)。B組和A組24和48 h劃痕愈合率比較差異無顯著性(t=0.583、0.972，P>0.05)，C組24和48 h劃痕愈合率低于B、A組，差異具有顯著意義(t=7.299～13.964，P<0.05)。結果見表3和圖3。Transwell實驗結果顯示，C、B和A組侵襲細胞數比較差異有顯著性(F=66.073，P<0.05)；B組和A組侵襲細胞數比較差異無顯著性(t=1.287，P>0.05)；C組侵襲細胞數低于B、A組，差異具有顯著性(t=11.062、9.496，P<0.05)。見表3和圖4。

表3 各組細胞遷移和侵襲能力比較

3 討 論

白血病是導致兒童期病兒死亡的常見的惡性腫瘤之一，其中以ALL最為常見，約占白血病類型的75%以上[9-10]。目前，隨著化療方案的不斷優化，兒童ALL總體5年無事件生存率約為90%[11-12]；但仍有部分病兒最終出現復發，而復發病兒再次緩解失敗風險高、生存時間縮短，預后極差[13-16]。因此，發現和確定兒童ALL發生、進展及復發相關的高危mRNA，對指導治療及提供治療靶點具有重要意義。Septin-9 mRNA位于人染色體17q25.3，在細胞質分裂、細胞極化、細胞膜重構等多種生物學過程中發揮重要作用[17-18]；Septin-9是潛在的原癌基因，其異常表達可引起細胞極性丟失、形態改變，增加了細胞癌變風險[19-21]；且與腫瘤細胞異常增殖及凋亡密切相關[22-23]。現有研究表明，Septin-9在乳腺癌、人腎細胞癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織中表達異常[21，24-26]。本研究結果顯示，初診病兒骨髓單個核細胞中Septin-9 mRNA相對表達量高于對照組，說明Septin-9 mRNA在ALL病兒骨髓單個核細胞中表達異常增加，可能參與了ALL發病；同時，隨著臨床危險度分級升高，Septin-9 mRNA相對表達量逐漸升高，提示Septin-9 mRNA表達與危險度分級有關，可作為評估ALL病兒危險度分級的指標。本研究結果還顯示，復發病兒骨髓單個核細胞中Septin-9 mRNA相對表達量高于初診和緩解病兒，且初診病兒高于緩解病兒。說明Septin-9在ALL病兒骨髓單個核細胞中表達與病兒治療效果有關。

為進一步觀察Septin-9對ALL細胞生物學功能的影響，本研究利用小分子RNA干擾技術特異性抑制人Jurkat細胞中Septin-9 mRNA表達。結果顯示，C組細胞中Septin-9蛋白相對表達量低于B、A組，提示C組細胞中Septin-9 mRNA表達被成功抑制。本研究結果顯示，C組24、48、72和96 h細胞增殖能力低于B、A組，表明特異性抑制了人Jurkat細胞中Septin-9 mRNA表達，可有效抑制細胞增殖，提示Septin-9可能參與了細胞增殖過程[27]。

A：A組；B：B組；C：C組。

圖2各組細胞周期的變化

A：A組；B：B組；C：C組。

A：A組；B：B組；C：C組，結晶紫染色，200倍。

細胞周期檢測結果顯示，C組G0/G1期細胞比例高于B、A組，而S期細胞比例低于B、A組，表明抑制Septin-9 mRNA表達可抑制細胞周期由G0/G1期轉化為S期，提示Septin-9可能通過改變細胞周期而參與調節細胞增殖[28-29]。本研究結果顯示，C組24 和48 h劃痕愈合率、侵襲細胞數均低于B、A組，表明抑制Septin-9 mRNA表達可有效抑制細胞遷移和侵襲能力[30]，提示Septin-9可能參與了人Jurkat細胞遷移和侵襲過程。

綜上所述，Septin-9在ALL病兒骨髓單個核細胞中呈高表達，且與臨床危險度分級和復發有關，特異性抑制人Jurkat細胞中Septin-9 mRNA表達，可能通過改變細胞周期而抑制細胞增殖；同時，可抑制細胞遷移和侵襲能力，有望為ALL發病機制研究及mRNA靶向治療提供新的靶點。