凱氏定氮法測定蛋白質的方法分析

◎ 李杉杉

（眉山職業技術學院，四川 眉山 620000）

蛋白質在生物體內非常重要，幾乎參與所有的生命活動，蛋白質不僅與新陳代謝、免疫和生物進化有很大關系，而且還提供很多信息。蛋白質含量常作為衡量食品中營養價值高低的一項重要指標，因此蛋白質含量的檢測在食品分析中尤為重要，一直以來都是研究的熱點。

根據GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，在食品中蛋白質的測定方法有凱氏定氮法、分光光度法和燃燒法[1]。雖然凱氏定氮法操作復雜、試劑消耗大，但其測試結果準確性和重現性好，是目前測定有機化合物含氮量最常用，也是最經典的方法之一[2]。本文分析凱氏定氮法在實際操作中存在的問題。

1 測定原理及儀器

1.1 測定原理

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法[3]，在食品中的蛋白質在催化劑催化并加熱條件下，蛋白質分解后的產物氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收游離氨后以標準硫酸或標準鹽酸滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質的含量[4]。

1.2 儀器與試劑

（1）儀器。天平、定氮蒸餾裝置、自動凱氏定氮儀和消化爐。

（2）試劑。硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、氫氧化鈉和95%乙醇。

2 測定方法優點及存在的問題

2.1 測定方法優點

2.1.1 準確度高

凱氏定氮的測定結果相對準確，重現性好，在國內各大檢驗機構中比較普及。

2.1.2 靈敏度低，抗干擾

凱氏定氮法的靈敏度低、干擾少，適用于0.2～1.0 mg氮，誤差為（±2%），且樣品使用量少[5]。

2.1.3 應用廣泛

凱氏定氮法應用很廣泛，幾乎適用所有形態的食品，對于一些類似于不溶解的樣品，也能適用凱氏定氮法測定蛋白質。

2.1.4 使用設備簡單，實驗費用低

凱氏定氮法需要的設備相對簡單，所需設備和試劑較少，實驗設備和試劑價格相對便宜，且實驗操作難度小。

2.2 測定過程中存在的問題

2.2.1 消化時間過長

采用凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量所需時間較長，完成整個操作流程需要7～10 h，且試劑消耗量大。

2.2.2 消化過程中易產生泡沫，掛壁，導致消化不完全

食品中的有機物質除了蛋白質外，還有脂肪和糖類等，在加熱過程中易產生泡沫附在定氮瓶口或者消化管口，同時消化過程中產生的冷凝酸液不易將吸附物質洗下，導致消化物質減少，測定結果偏低。

2.2.3 消化液易產生結晶、渾濁

待消化完成后，在定容過程可以發現消化液過于黏稠，且有部分結晶物質，導致消化液不澄清、透明。

2.2.4 定氮蒸餾裝置搭建復雜，玻璃材質易破碎

常規定氮蒸餾裝置由電爐、水蒸氣發生器、反應室、冷凝管、接收瓶等組成，組裝搭建整個定氮蒸餾裝置較復雜，同時各接口處比較脆弱，易破碎。

3 針對問題的解決方法

3.1 改變消化試劑的添加時間、添加量、添加種類

針對消化時間較長問題，可以采用定時定量添加消化試劑，在添加硫酸的基礎上，添加少量的過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑可加速有機物的氧化分解。

3.2 消化注意溫度的把控，添加消泡劑

針對消化過程中易起泡問題，可以從控制溫度上解決。在消化初期溫度不需太高，保持消化液微沸即可，待泡沫消化后在徐徐漸進的加強熱源，并定期旋轉定氮瓶，使掛壁物質消化完全。針對脂肪、糖類含量特別高的食品還可以添加少量消泡劑如辛醇或液體石蠟或硅油。

3.3 注意催化劑的添加量

國家標準中催化劑硫酸銅的添加量為0.4 g，無需多添加。如果添加過量消化結束后消化液冷卻后有可能會產生硫酸銅鹽結晶，可多加水、加熱使之溶解。但是產生的結晶不影響最終蛋白質含量的測定結果。針對消化液不易透明、澄清，可以待消化液冷卻后加入少量的過氧化氫后繼續消化至澄清、透明。

3.4 采用自動凱氏定氮儀

針對常規蒸餾裝置的復雜性、易損性，可以采用自動凱氏定氮儀。不僅操作簡單，同時可以縮短常規蒸餾裝置加熱時間，但是自動定氮儀較常規玻璃蒸餾裝置會耗用更過的試劑。

4 結語

作為三大營養物質之一，蛋白質是食品理化分析的重要指標。而目前凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量是各大企業、檢測機構采用的蛋白質檢測方法之一，也是各高校學生主要學習的方法。凱氏定氮法測定過程中出現的問題均可以解決，需要各企業、機構結合產品自身做出相應調整。