流式細胞儀快速定量檢測牛奶中沙門氏菌

王琪然

【摘 要】 本研究采用沙門氏菌多克隆抗體特異性標記沙門氏菌，并輔以膜選擇通透性熒光染料碘化丙啶（PI）來標記區分死菌和活菌，采用流式細胞儀進行定量檢測分析。實驗結果表明：流式細胞儀法方法的靈敏度為1.83 × 103 CFU/mL，與平板培養計數法相比，兩種方法的檢測結果具有很高的一致性，檢測時間由原先的3 d～5 d縮短至35 min。綜上所述，流式細胞儀法能快速、定量地檢測出牛奶樣品中的沙門氏菌，在食源性致病菌的快速篩查和監控中具有重要的應用價值。

【關鍵詞】 流式細胞儀；沙門氏菌活菌；快速檢測；牛奶

【中圖分類號】R197.3 【文獻標志碼】B 【文章編號】1005-0019（2018）24-245-01

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型（ATCC13311）、腸沙門氏菌腸亞種嬰兒血清型（CICC21482）、大腸桿菌（ATCC10798）、霍亂弧菌（CICC23794）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、副溶血弧菌（ATCC17802）、單增李斯特氏菌（ATCC19111）均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

牛奶中微生物快速純化試劑盒購于北京亦泰生物技術有限公司，偶聯有異硫氰酸熒光素（FITC）的沙門氏菌多克隆抗體購于美國Kirkegaard Perry Laboratories公司，核酸熒光染料碘化丙啶（PI）購于美國Thermo Fisher Scientific公司。全脂滅菌乳購于北京三元食品股份有限公司。

1.2 儀器與設備

A50-Micro型流式細胞儀 英國Apogee公司；恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；HZQ-X100型恒溫振蕩培養箱 江蘇太倉市實驗設備廠；1-14型離心機 美國Spectronics公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌懸濁液的制備

將本文1.1中所述的7種菌株分別接種于營養肉湯培養基中，在恒溫震蕩培養箱內37℃培養12 h。取菌液，12000 × g離心10 min，棄去上清液，底部沉淀用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸。用滅菌的PBS將重懸后的腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型（沙門氏菌ATCC 13311）純菌液進行10倍系列稀釋。

1.3.2 沙門氏菌的染色

將沙門氏菌ATCC 13311采用綠色熒光染料FITC標記的抗體進行特異性標記，再采用紅色熒光材料PI標記區分死菌與活菌，通過流式細胞儀的熒光通道進行檢測。。

1.3.3 流式檢測方法的特異性

將本研究1.1中的7種菌株制備成107 CFU/mL菌懸液，再將菌懸液分別與FITC標記的沙門氏菌多克隆抗體在37℃下孵育15 min，用流式細胞儀驗證其特異性。

1.3.4 流式檢測方法的線性與靈敏度

將沙門氏菌ATCC 13311用PBS溶液進行10倍系列稀釋，再分別采用國標中菌落總數測定的平板培養計數法和流式檢測法進行定量檢測，驗證流式檢測法的線性與靈敏度。

1.3.5 人工污染滅菌乳樣品的檢測

將沙門氏菌ATCC 13311接種到煮沸處理過的滅菌乳中，制備成人工污染的乳樣品，濃度為2.00 × 103～2.00 × 108 CFU/mL。按照牛奶中微生物快速純化試劑盒純化沙門氏菌說明書操作，去除滅菌乳中的蛋白顆粒和脂肪，得到純化的樣品溶液，經雙染色后，用流式細胞儀進行檢測。

2 結果與分析

2.1 流式檢測方法的線性與靈敏度

采用流式細胞儀法和平板培養計數法同時對10倍系列稀釋的沙門氏菌進行檢測。將菌液濃度在103～108 CFU/mL的檢測結果繪制出標準曲線，如圖1所示，流式檢測法與平板計數法線性良好（R2=0.9988），檢測范圍為2.27 × 103～3.49 × 108 CFU/mL，靈敏度為2.27 × 103 CFU/mL 。

2.2 流式細胞儀檢測方法的特異性

將本研究1.1中的7種菌株分別與沙門氏菌多克隆抗體在進行反應，只有沙門氏菌能檢測到綠色熒光。結果表明沙門氏菌多克隆抗體與除沙門氏菌外的菌株不發生反應，表明建立的流式細胞儀檢測方法特異性良好。

2.3 流式細胞儀法檢測死活菌的驗證 沙門氏菌與偶聯有FITC的多克隆抗體反應后，發出綠色熒光；而當沙門氏菌死菌和活菌與碘化丙啶反應后，只有死菌發出紅色熒光。因此，通過流式細胞儀檢測后，沙門氏菌活菌只會檢測到綠色熒光，死菌會檢測到紅色和綠色兩種熒光（如圖2所示），說明流式細胞儀法可以有效區分沙門氏菌死活菌。

2.4 人工污染牛奶樣品的檢測 人工污染牛奶樣品的檢測結果顯示（表1），當沙門氏菌的濃度在103 ～108 CFU/mL時，流式細胞儀法檢測沙門氏菌的檢測結果與添加濃度非常接近，說明流式檢測方法準確性良好。而當沙門氏菌的濃度大于108 CFU/mL或者小于103 CFU/mL時，超出儀器檢測限。因此，人工污染牛奶樣品中流式檢測方法的檢測范圍為1.83 × 103～1.99 × 108 CFU/mL，靈敏度為1.83 × 103 CFU/mL。

3 討論

本研究所建立的流式細胞儀方法檢測牛奶中沙門氏菌靈敏度為1.83 × 103 CFU/mL、特異性良好，檢測時間僅需35 min，與傳統的平板計數法、免疫膠體金試紙條法、電阻抗法以及熒光PCR方法相比較，檢測時間明顯地縮短。綜上所述，本研究所建立的流式細胞儀檢測方法不僅適用于液態牛奶的檢測，同時也適用于奶粉樣品的檢測。因此本研究建立的方法可以快速、靈敏、高效地篩查奶粉是否被沙門氏菌污染。

參考文獻

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