超高效液相色譜-串聯質譜法測定食品中堿性嫩黃O的含量

◎ 夏莉娟，馮秀娟

（1.寧夏回族自治區食品藥品審評查驗中心，寧夏 銀川 750001；2.寧夏回族自治區食品檢測研究院，寧夏 銀川 750001）

堿性嫩黃O，又稱奧拉明O，呈黃色粉末狀，是一種工業染料，主要用于醋纖、棉織品的染色，還可用于紙張、皮革、油漆等的著色，一般接觸或者吸入都會引起中毒。GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》[1]規定，嚴禁將堿性嫩黃O作為食品添加劑使用，但一些不法商販為使腐竹、豆皮的色澤光亮，把堿性嫩黃O非法加入到豆制品中（如腐竹、豆皮、豆干等），嚴重危害了廣大消費者的身體健康[2]。目前，對食品中堿性嫩黃O的檢測方法有高效液相色譜法[3-8]、高效液相色譜-串聯質譜法[9]，相關標準有DB33/T 703-2008《食品和農產品中多種堿性工業染料的測定 液相色譜-串聯質譜法》[10]和DBS 22/006-2012《食品中酸性橙、堿性橙2和堿性嫩黃的測定 液相色譜-串聯質譜法》[11]。食品中堿性嫩黃O檢測時往往受到其他組分的干擾，一般需要采用梯度洗脫，有的食品基質中其他組分的干擾較多，在前處理過程中需要凈化。目前建立的許多液相色譜-串聯質譜法都未經凈化處理，很大程度上影響了檢測效果。本方法優化了樣品處理方式，引入GPC凈化系統，建立了測定食品中堿性嫩黃O的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法并對市場上的部分豆制品樣品進行抽檢，以確定建立的UPLC-MS/MS檢測方法的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

①樣品。樣品為市場隨機抽查的各類豆制品，包括豆干、豆腐、豆皮、腐竹、油皮。②儀器。安捷倫液相色譜串聯四級桿質譜儀(安捷倫公司出品)、離心機、電子天平、凝膠色譜儀、旋轉蒸發儀。③試劑。甲醇（AR，國外進口）、甲酸（色譜純）、環己烷（AR）、乙酸乙酯（AR），所用試劑除特別標注外均為分析純試劑，水為超純水。④定溶液。0.1%甲酸甲醇溶液+0.1%甲酸水溶液=70+30（V/V）。⑤標準物質。堿性嫩黃O標準物質。

1.2 檢測方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Ecipse-C18，3.5 μm，2.1×100 mm；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸甲醇溶液=30∶70；流速：0.2 mL·min-1；進樣量：10 μL。流動相梯度洗脫情況見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件表

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；掃描方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；霧化器壓力：10 L·min-1；離子源溫度：350 ℃。質譜分析參數見表2。

表2 堿性嫩黃O的監測離子對表

1.2.3 標準使用液的配制

準確稱取堿性嫩黃O標準物質，用定溶液配制成100μg·mL-1的標準儲備溶液。臨用前，用定溶液根據需要稀釋配制成適當濃度的系列標準使用液，分別為2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 ng·mL-1和 100.00 ng·mL-1。

1.2.4 樣品的處理

1.2.4.1 提取

稱取200 g樣品，破碎均勻，然后稱取1.00 g樣品置于10 mL具塞玻璃離心管中，加入（1+1）乙酸乙酯：環己烷溶解，定容至10.0 mL，渦旋混合1 min，超聲提取 10 min，4 000 r·min-1離心 5 min。

1.2.4.2 凈化

凝膠色譜條件：凝膠凈化柱，流動相為乙酸乙酯∶環己烷（1∶1），流速3.5 mL·min-1，5 mL定量環，預淋洗20 min，凝膠色譜平衡8 min，8～18 min收集。吸取5.0 mL離心上清液（1.2.4.1）過GPC柱進行凈化。將收集的洗脫液旋轉至干。加入1.0 mL定溶液定容。0.22 μm膜過濾，上機測定。

1.2.5 計算公式

樣品中堿性嫩黃O的含量X按公式（1）計算：

式中，X-試樣中待測組分含量，單位為μg·kg-1；C-待測液中堿性嫩黃O的濃度，單位為ng·mL-1；C0-空白待測液中堿性嫩黃O的濃度，單位為ng·mL-1；V-樣品測試樣的最后定容體積，單位mL；m-樣品質量，單位為g。

2 檢驗結果

2.1 定性與定量

（1）定性。采用保留時間及相對離子豐度的最大允許偏差來定性，見表3。樣品譜圖中定性離子的相對豐度與濃度接近的標準品譜圖中定性離子的相對豐度進行比較，偏差若在表3允許的偏差范圍內，則可判定該待測物為目標物。

表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差表

（2）定量。將標準溶液及樣品同時上機，進樣量為10 μL，采用外標法定量。其中，定量離子對（m/z）268.2/147.1用來定量，定性離子對（m/z）268.2/252.1輔助定性。標準溶液的質譜圖及MRM譜圖見圖1～2，樣品的質譜圖見圖3。

圖1 堿性嫩黃O標準品質譜圖

圖2 堿性嫩黃O標準品MRM譜圖

圖3 豆腐樣品質譜圖

2.2 方法的線性范圍及檢出限

在優化的條件下，測定配制的2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 ng·mL-1和 100.00 ng·mL-1系 列 濃度的堿性嫩黃O標準使用液，標準曲線如圖4所示。由圖4可知，其峰面積呈現良好的線性關系，回歸方程為Y=3891.17X-2210.36，相關系數達0.999 4，重現性好，靈敏度高，儀器的檢測限為0.25 ng·mL-1，方法的檢出限為 0.5 μg·kg-1。經測試，含量為 0.5 μg·kg-1時的色譜峰信噪比S/N＞3。

圖4 堿性嫩黃O標準曲線圖

2.3 回收率及精密度試驗

2.3.1 精密度實驗

將配制的20 ng·mL-1堿性嫩黃O標準溶液連續反復進樣6次（n=6），結果表明堿性嫩黃O含量RSD為1.2%，說明在該質譜條件下實驗設備具有良好的可靠性。

2.3.2 不同樣品在同一加標水平的回收率

隨機選取不同樣品統一加入1.0 mL 100 ng·mL-1的標準溶液進行加標試驗，樣品平行測定6次，同時做空白樣試驗，檢測其本底成分，結果見表4。由表4可知：樣品中均含有不同量的本底值，扣除空白后，樣品本身含量為零。回收率范圍為78.6%～115.3%、RSD值在8.0%～9.7%，說明基質對檢測結果的影響很小，方法重現性好，準確可靠。

表4 堿性嫩黃O的回收率及精密度試驗表

2.3.3 同一樣品在不同加標水平的回收率

取1.0 g空白樣品（豆腐）添加堿性嫩黃O標準溶液，其濃度依次為 10.0、20.0、50.0 ng·mL-1，每個添加量平行6份，進行加標回收率實驗，回收率、相對標準偏差如表5所示。

表5 豆腐中堿性嫩黃O的回收率及相對標準偏差表

2.4 實際樣品測定

采用1.2的方法對市售的豆干、豆腐、豆皮、腐竹和油皮豆制品，共25份樣品中的堿性嫩黃O進行了檢測，結果所有樣品均未檢出堿性嫩黃O。

3 結論

本試驗建立了測定食品中堿性嫩黃O的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法。該方法前處理采用GPC進行凈化，能夠很好的凈化和富集樣品并解放勞動力，大大提高工作效率。該方法操作簡便、靈敏度高、準確性和重現性好，儀器檢測限為0.25 ng·mL-1，方法的檢出限為0.5 μg·kg-1（S/N＞3），可作為食品安全檢測中檢測堿性嫩黃O的快速有效檢測方法。