非酒精性脂肪肝患者血清中exosomes的水平及意義

石柳 湯建華 溫建軍 曹德清 劉雪 林曄 張靜智

【摘要】 目的：探討非酒精性脂肪肝患者血清中exosomes的水平及其對肝細胞脂代謝的影響。方法：通過Western-blotting，透射電鏡、Nanosight鑒定exosomes；并通過BCA蛋白定量的方法檢測19例NAFLD患者（NAFLD組），18例健康對照（健康對照組）血清中exosomes內蛋白含量；將10 μg的exosomes與HepG2細胞共培養，48 h后，收集細胞，GPO-PAP法檢測其中總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）的表達；通過Western-blotting檢測腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化水平。

結果：exosomes高表達CD9、CD63、CD81，呈圓形或橢圓形，直徑在40～210（110.00±21.36） nm。NAFLD組中的exosomes蛋白水平明顯高于健康對照（P<0.05）。exosomes與HepG2細胞共培養后，其TC、TG的表達水平與對照組相比明顯上調，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：exosomes可影響AMPK通路的活性，在肝細胞的脂代謝過程中發揮了重要作用，促進了非酒精性脂肪肝的發展。

【關鍵詞】 非酒精性脂肪肝； exosomes； AMPK； 脂肪代謝

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種慢性代謝應激性肝損傷，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關，發病率在全球范圍內達10%～40%[1]。其病理改變與酒精性肝損傷類似，但患者無酗酒病史。近年來，NAFLD的發病率呈快速增長且趨低齡化，與心血管死亡率增加具有相關性，已成為影響人類健康的重要障礙之一[2-3]。高血脂、高血糖、肥胖是NAFLD的危險因素，然而其發病機制十分復雜，目前的報道提出的“二次打擊”學說，四步驟學說等均不能完全解釋清楚其發病機制[4]。

外泌體（exosomes）是一種由細胞分泌的，直徑為40～100 nm的小囊泡參與胞間通訊，介導多種生理及病理過程[5]。exosomes包含著蛋白質、microRNA、LncRNA等生物活性物質[6]。exosomes由于具有膜性結構，能穩定存在不易被降解，可將有效的生物活性物質運送至靶組織發揮作用。本研究通過檢測NAFLD患者血清中exosomes的水平及其對肝癌細胞HepG2的作用，探索其在NAFLD進展中的作用。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取NAFLD患者19例（NAFLD組，男10例，女9例），同時選取年齡性別匹配的體檢健康者18例（健康對照組，男9例，女9例）。納入標準：（1）2016年6月-2017年6月本院就診的NAFLD患者；（2）本研究所需的檢查資料完整；（3）所有入組對象均簽署知情同意書。排除標準：（1）病毒性、藥物性、酒精性等原因引起的肝臟疾病；（2）長期大量飲酒病史；（3）嚴重的心、腎臟疾病及其他內分泌系統疾病。NAFLD的診斷標準按照中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）》。本研究通過醫院醫學倫理委員會批準，抽取外周靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。

1.2 試劑和儀器 人肝癌細胞株HepG2（武漢中國典型培養物保藏中心），exosomes提取試劑盒（銳博公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天公司），酶標儀（Bio-Tek公司），兔多克隆抗體AMPK（CST公司），兔多克隆抗體p-AMPK（CST公司），Nanosight（技術服務），透射電子顯微鏡（技術服務），TC、TG檢測試劑盒（南京建成生物）。

1.3 血清中exosomes的蛋白含量檢測 收集研究對象的外周血血清250 mL，按銳博試劑盒說明書進行exosomes的提取。取20 μL樣品用RIPA裂解后，通過BCA法檢測其蛋白含量。

1.4 exosomes的鑒定 通過Western-blotting法檢測exosomes的表面特異性標記CD9、CD63、CD81，Nanosight其直徑分布。投射電鏡觀察其形態。

1.5 GPO-PAP法測定TC、TG的表達水平 將10 μg的exosomes加入HepG2細胞中共培養48 h后，收集細胞加入裂解液，按TC、TG測定試劑盒進行檢測。

1.6 AMPK磷酸化水平檢測 Western-blotting檢測細胞裂解物中AMPK的磷酸化水平。

1.7 統計學處理 本研究所有數據采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗或Manne Whitney U檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 exosomes的鑒定 Western-blotting結果示，exosomes表達CD9、CD63、CD81（圖1A），通過透射電鏡下觀察exosomse的形態，其呈圓形（圖1B），Nanosight示直徑為（110.00±21.36）nm，帶有完整的膜性結構（圖1C，Bar 200 nm）。

2.2 不同來源血清exosomes中蛋白含量的比較 NAFLD組和健康對照組，分離提取exosomes后，BCA結果示，NAFLD組exosomes中的蛋白含量為（1.31±0.15）mg/mL，明顯高于健康對照組的（0.72±0.12）mg/mL，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 exosomes影響HepG2細胞TC、TG的表達 10 μg的exosomes與 HepG2細胞共培養48 h后，檢測細胞裂解物中TC、TG的表達水平，結果顯示，NAFLD組患者來源的exosomes能促進HepG2細胞表達TC、TG，其中TC為（0.85±0.23）mmol/gprot vs （0.15±0.07）mmol/gprot，TG為（0.97±0.18）mmol/gprot vs （0.28±0.06）mmol/gprot，且差異均有統計學意義（P<0.05），見圖3。

2.4 exosomes對HepG2細胞AMPK磷酸化水平 AMPK信號通路是脂肪代謝最重要的途徑之一，exosom是否通過該通路調控HepG2細胞的脂代謝呢？進一步檢測exosomes對HepG2細胞AMPK磷酸化水平的影響，Western-blotting結果示，與健康對照組相比，NAFLD組患者來源的exosomes能抑制AMPK的磷酸化水平，AMPK的活性受到了抑制，見圖4。

3 討論

NAFLD表現為彌漫性的肝實質細胞脂肪變形壞死，患者無過量飲酒史，肥胖、2型糖尿病、血脂、血壓異常也增加了NAFLD的患病風險，這幾個因素之間相互影響[7]。近年來對NAFLD的診斷及治療得到了很大的提升，然而其發病率仍居高不下，療效仍欠佳。隨著研究的不斷深入，研究者發現了exosomes參與了許多疾病的發生及發展，在機體不同系統之間的通訊起了重要的作用。Peinado等[8]研究發現，惡性黑色素瘤的exosomes可調節骨髓祖細胞的活動，從而促進腫瘤的轉移，且exosomes的表達水平與患者的預后密切相關。同時，不斷有研究指出，exosomes在疾病的不同發展時期有著特異性表型，尤其在肝臟疾病中，exosomes可影響肝細胞的生長方式[9-10]。因此，有學者提出exosomes可能作為一個潛在的疾病生物學標記物，可作為液體活檢應用于包括NAFLD在內的慢性疾病中[10-12]。

本研究結果顯示，血清中exosomes水平與NAFLD具有密切的關系。在NAFLD患病組中的exosomes水平與健康對照相比明顯升高（P<0.05），這表明，exosomes在一定程度上反映了NAFLD疾病的發展程度。其可能的原因是：exosomes具有的脂質雙分子膜性結構使得其可將核酸、蛋白質等生物活性物質隨體液循環運輸至全身各器官組織，調控靶細胞的生命活動。在NAFLD進展過程中，各系統代謝出現異常，因此出現exosomes的改變。同時，文獻[12-14]報道，胃癌患者血清中的exosomes與腫瘤的轉移、TNM分期及分化程度密切相關。許多研究指出，exosomes可作為載體將RNA轉移至遠處組織，并在受體細胞中檢測目的蛋白的表達[15-16]。這表明，exosomes可穩定地運輸RNA，并借用靶細胞中的翻譯工具完成蛋白的表達。有趣的是，最近有研究指出，檢測血液中exosomes的蛋白磷酸化水平可作為監測乳腺癌進展的手段[17]。以往的研究表明，蛋白的磷酸化和去磷酸化可作為許多生命活動的開關，直接調控疾病的發生發展。本研究中，筆者也發現了在NAFLD來源的exosomes可抑制HepG2細胞的AMPK的磷酸化水平，從而影響其脂代謝過程，導致甘油三酯和總膽固醇的累積。據報道，AMPK是脂代謝途徑最重要的蛋白之一，其活性受抑制后，可導致脂肪沉積及胰島素抵抗[18-20]。由此，exosomes可能攜帶了母細胞的某些活性物質至靶細胞，影響靶細胞的功能，最終通過級聯效應，影響肝臟細胞分解代謝脂肪。與我們的研究結果一致，于寧等[21]也提出，膽汁中的exosomes可以下調細胞外信號調節激酶1/2的磷酸化水平，促進miR-15A的表達，從而導致抑制膽管上皮細胞的生長。由此，exosomes在肝臟疾病的發展中發揮著重要作用。可以通過檢測血清中exosomes測患者的疾病進展，替代病理學對疾病進行診斷，作為無創診斷的標志物。以exosomes為代表的液體活檢的發展，將大大促進對NAFLD的診治。

本研究創新性地提出了exosomes通過攜帶生物活性物質，影響靶細胞的AMPK磷酸化水平，從而影響了NAFLD的發展，為疾病的診治提出了新的靶點。然而，由于缺乏對exosomes作用機制的深入研究，本研究仍無法闡釋exosomes如何通過AMPK影響NAFLD的進展。下一步應通過蛋白組學研究exosomes的成分，并通過生物信息學分析，篩選可能作為exosomes作用“幫手”的目的蛋白，進一步揭示exosomse的作用機制，為其進一步應用提供理論基礎。

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（收稿日期：2018-05-29） （本文編輯：程旭然）