木本油料文冠果APETALA2基因全長cDNA序列與生物信息學分析

劉曉輝+馬靜怡+羅媛+李志民+王莉

摘要 文冠果是我國北方特有的木本油料樹種。AP2是植物種子發育調控的重要轉錄因子。根據已獲得的文冠果轉錄組數據搜索文冠果AP2基因序列（XsAP2），并對XsAP2基因全長cDNA序列進行生物信息學分析。結果表明，XsAP2基因cDNA序列包含1個長度為1 548 bp的完整ORF，編碼515個氨基酸。XsAP2蛋白大部分區域為親水區，由136個ɑ螺旋、89個延伸鏈、43個β-轉角、247個無規則卷曲構成。依據2gcc.1.A同源建模法，獲得1個三級結構模型，該模型從第153個氨基酸開始到第213個氨基酸結束。XsAP2蛋白與9種其他植物AP2蛋白的同源性分析顯示，文冠果AP2與可可AP2的同源性最高（71%）。該結果可為解析文冠果種子生長發育的分子調控機制提供理論依據，并有助于文冠果油品質改良和文冠果分子育種工作。

關鍵詞 文冠果；APETALA2基因；cDNA；親水性；ɑ螺旋；同源性

中圖分類號 S794.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）02-0145-02

文冠果是我國北方特有的木本油料樹種，其種仁含油量高達50%～70%，富含油酸、亞油酸、神經酸等優質不飽和脂肪酸[1]，是國家“十三五”期間大力發展的新型健康木本食用油，在許多工業領域如制藥與生物質能源等方面也具有重要的用途。因此，挖掘調控文冠果種子發育的重要轉錄因子基因，對提高文冠果種子產量和含油量具有重要意義。

AP2/ERF轉錄因子是植物最大的轉錄因子家族之一，含有1～2個保守的AP2/ERF結構域[2-3]。其中AP2亞家族轉錄因子主要參與植物花、果實和種子等器官生長發育的調控[4]。APETALA2是AP2亞家族的成員之一，已相繼在擬南芥、水稻和葡萄等物種中分離出來[5]，而在文冠果中AP2轉錄因子方面的研究還較少。因此，本研究在測序獲得的轉錄組數據中篩查文冠果APETALA2（AP2）基因的全長cDNA序列，通過生物信息學方法分析AP2轉錄因子的結構特征及功能，為解析文冠果種子生長發育的分子調控機制提供依據，有助于文冠果油品質改良和文冠果分子育種工作。

1 材料與方法

1.1 搜索轉錄組獲得新基因序列

從本研究室測序獲得的文冠果根、莖、葉的de novo轉錄組數據中搜索獲得文冠果AP2基因的cDNA序列。

1.2 文冠果AP2基因cDNA序列的生物信息學分析

利用ORFfinder在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測XsAP2基因cDNA序列的ORF。采用Prot-Param在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）預測XsAP2蛋白序列的一級結構。通過ProtScale在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析XsAP2蛋白的疏水性/親水性。利用SOPMA在線軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_ sopma.pl）預測XsAP2蛋白序列的二級結構。采用SWISS-MODEL軟件（http：// www.swissmodel.expasy.org/）預測XsAP2蛋白的三級結構。

1.3 文冠果AP2蛋白與其他植物AP2蛋白氨基酸序列的同源性比較

從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載9種植物（可可、甜橙、葡萄、木本棉、木薯、千年桐、土瓶草、陸地棉和麻風樹）的AP2氨基酸序列。然后利用DNAMAN軟件將文冠果和9種其他植物的AP2氨基酸序列進行同源性比對。

2 結果與分析

2.1 文冠果XsAP2基因cDNA序列的ORF預測

依據本實驗室已獲得的文冠果轉錄組數據，搜查獲得文冠果AP2基因的全長cDNA序列。使用ORF Finder軟件，根據標準遺傳代碼查找XsAP2的開放讀碼框（ORF），結果顯示，AP2基因ORF序列長度為1 548 bp，可編碼515個氨基酸（圖1）。

2.2 XsAP2基因編碼蛋白質一級結構預測

利用ProtParam在線軟件對XsAP2基因編碼的蛋白質的結構預測見表1。XsAP2蛋白分子式為C2482H3827N755O801S16，相對分子質量為57 572.23，等電點為6.38，蛋白質不穩定系數為60.47。

2.3 XsAP2蛋白疏水性/親水性分析

利用ProtScale在線軟件對XsAP2蛋白序列進行疏水性/親水性預測，根據線性質量差異模型，得到蛋白質親疏水性信號（圖2）。圖2中可見XsAP2蛋白的疏水性最大值為0.989，最小值為-3.511，總體來看XsAP2大部分氨基酸屬于親水性氨基酸。

2.4 XsAP2蛋白序列的二級結構預測

基于蛋白質數據庫，利用SOPMA在線軟件對XsAP2蛋白序列進行二級結構預測（圖3）。結果表明，XsAP2蛋白由136個ɑ螺旋、89個延伸鏈、43個β-轉角、247個無規則卷曲構成，分別占據26.41%、17.28%、8.35%、47.96%，即XsAP2蛋白質無規則卷曲所占比例最高。因此，可以推測文冠果XsAP2蛋白質二級結構中最大量的結構原件是以無規則卷曲的形式存在，ɑ螺旋、β-轉角和延伸鏈分散在整個蛋白質中。

2.5 XsAP2蛋白序列的三級結構預測

使用同源建模法，將文冠果AP2蛋白序列提交至SWISS-MODEL，見圖4。依據2gcc.1.A同源建模法，獲得1個三級結構模型（圖4），該模型從第153個氨基酸開始到第213個氨基酸結束。該蛋白質主要由無規則卷曲、ɑ螺旋、β-轉角和延伸鏈組成，三級結構預測與二級結構預測的結果基本一致。endprint

2.6 文冠果XsAP2蛋白序列與其他植物AP2蛋白序列的同源性比較

文冠果XsAP2氨基酸序列提交NCBI在線比對，選擇與其同源性較高的9種植物的AP2氨基酸：可可AP2（Theobroma cacao，XP_007047337）、甜橙AP2（Citrus sinensis，KDO79131）、葡萄AP2（Vitis vinifera，XP_010652782）、木本棉AP2（Gossypium arboretum，XP_017627516）、木薯AP2（Manihot esculenta，OAY 35492）、千年桐AP2（Vernicia montana，APQ47383）、土瓶草AP2（Cephalotus follicularis，GAV88830）、陸地棉AP2（Gossy-pium hirsutum，XP_016679121）、麻風樹AP2（Jatropha curcas，XP_012079274）。使用 DNAman 軟件將這些序列進行比對，發現不同植物的氨基酸序列同源性較高，其中文冠果與可可的同源性最高，達到71%。

3 結論與討論

文冠果XsAP2蛋白是AP2/ERF轉錄因子家族成員之一，有研究報道在牡丹AP2蛋白中存在2個AP2/ERF結構域[6]，這2個結構域在不同物種中具備很高的保守性。本研究通過將文冠果AP2氨基酸序列與NCBI Nr數據庫中其他植物的AP2氨基酸序列進行同源性比較，發現文冠果XsAP2與可可、甜橙、葡萄、千年桐、陸地棉、麻風樹等9種植物均有較高的同源性，其中與可可的同源性最高（71%），與甜橙和陸地棉的同源性相對較低（66%）。這說明文冠果與其他高等植物在AP2氨基酸序列上存在較長的保守區域，且保守區域為2個AP2/ERF結構域，從而在進化上相對較為保守。本研究通過搜索文冠果轉錄組數據獲得文冠果AP2/ERF家族轉錄因子，對開展文冠果高油新品種分子育種工作提供重要參考價值，也為下一步利用試驗方法研究該基因的結構功能方面奠定基礎[7]。

4 參考文獻

[1] 趙娜，張媛，李秋琦，等.文冠果FAD2的序列與功能分析[J].北京林業大學學報，2015，37（2）：87-93.

[2] ZHANG C H，SHANDGUAN L F，MA RJ，et al.Genome-wide analysis of the AP2/ERF superfamily in peach（Prunus persica）[J].Genet Mol Res，2012，1：4789-4809.

[3] DIETZ K J，VOGEL M O，VIEHHAUSER A.AP2/EREBP transcription factors are part of gene regulatory networks and integrate metabolic，hormonal and environmental signals in stress acclimation and retrograde signaling[J].Protoplasma，2010，245：3-14.

[4] OKAMURO J K，CASTER B，VILLARROEL R，et al.The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：7076-7081.

[5] LICAUSI F，GIORGI F M，ZENONI S，et al.Genomic and transcriptomic analysis of the AP2/ERF superfamily in Vitis vinifera[J].BMC Genomics，2010，11：719.

[6] 任磊，王雁，周琳，等.牡丹PsAP2基因的克隆及表達[J].林業科學，2011，47（9）：50-56.

[7] 敖妍，段劼，于海燕，等.文冠果研究進展[J].中國農業大學學報，2012，17（6）：197-203.endprint