二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠IL-1 IL-6 TNF-α的影響*

黃輝，黃炫賡，于大海，羅智杰，郭夢竹（.廣西醫科大學附屬口腔醫院民主門診部，廣西南寧5002；2.廣西醫科大學第二附屬醫院內分泌科，廣西南寧50007；.廣西醫科大學第一附屬醫院口腔科，廣西南寧5002）

慢性牙周炎是一種始發于牙菌斑的慢性非特異性炎癥，齦下大量病原微生物的繁殖及代謝產物和宿主間的免疫反應是促進疾病發展的重要因素。牙周炎與糖尿病關系密切，是糖尿病的主要并發癥之一[1]，影響著血糖的控制[2]，而血糖控制則影響著牙周炎的發生發展及預后。鹽酸二甲雙胍除具有傳統的降糖作用外，對骨組織似有保護作用[3]，也有一定的抗感染作用[4]。因此，本文將探討二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠中相關因子[白細胞介素-1（IL-1）、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）]表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 IL-6檢測試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司），TNF-α檢測試劑盒（上海森雄科技實業有限公司），IL-1檢測試劑盒（合肥蘭旭生物技術有限公司），酶標儀（美國Bio-Red公司）。

1.1.2 實驗動物 從廣西醫科大學動物中心分批采購同種系的清潔級Wistar雄性大鼠240只，每只200 g左右。由電腦生成隨機數字，并由此隨機分為實驗組、糖尿病性牙周炎組、單純牙周炎組和空白對照組，每組60只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立

1.2.1.1 糖尿病模型建立 大鼠適應性喂養3 d，給予足量的飼料，自由飲水。禁食12 h，將鏈脲佐菌素（STZ）在使用前用0.1 mol/L、pH 4.5的枸櫞酸緩沖液配制成2%濃度，按照60 mg/kg的劑量，一次性腹腔注射。3 d后取大鼠尾靜脈血檢測血糖，≥19 mmol/L納入實驗組；＜19 mmol/L 則繼續腹腔注射 STZ（30 mg/kg），3 d后再測血糖，≥19 mmol/L納入實驗組，＜19 mmol/L排除。

1.2.1.2 牙周炎模型建立 實驗組、糖尿病性牙周炎組大鼠在糖尿病模型建立3 d后，以及單純牙周炎組大鼠在喂養3 d后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用直徑0.2 mm正畸結扎絲加絲線結扎大鼠右上頜第一磨牙牙頸部。空白對照組大鼠適應性喂養3 d后，注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。3 d后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，不作干預待其自然蘇醒。

1.2.1.3 模型建立后的喂養及處理 四組大鼠繼續普通飼料喂養。實驗組大鼠給予100 mg/（kg·d）二甲雙胍灌胃，其他組給予同體積蒸餾水灌胃。在模型建立、結扎后3、6、9周，每組每批取10只大鼠的尾靜脈血。

1.2.2 檢測指標 以酶聯免疫吸附試驗檢測尾靜脈血中IL-1、IL-6、TNF-α活性情況，按照檢測試劑盒說明書具體步驟操作，應用酶標儀在450 nm處測定光密度值（OD450值）。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，檢驗水準α=0.05，用重復測量數據方差分析進行數據分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組中各因子術前、術后3、6、9周水平的變化 與術前相比，實驗組術后3、6、9周各因子水平均有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；而其他組的各因子水平無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 球形檢驗結果 IL-1的4次重復測量數據之間存在高度相關性，球形檢驗結果比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；而IL-6和TNF-α的球形檢驗結果比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.3 個體內變異部分的計算結果 IL-1、IL-6和TNF-α 3個因子的時間及時間×分組比較，差異有統計學意義P＜0.01），時間及時間×分組的交互作用比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表 3。

2.4 個體間變異部分的計算結果 不同組別、不同時間點的IL-1、IL-6和TNF-α水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 4。

2.5 各組各個時點重復測量IL-1、IL-6和TNF-α水平的均數變化趨勢 術前（模型建立后）空白對照組大鼠的IL-1、IL-6和TNF-α水平最低，其次是單純牙周炎組，最高是糖尿病性牙周炎組和實驗組。空白對照組、單純牙周炎組、糖尿病性牙周炎組大鼠術后3、6、9周的IL-1、IL-6和TNF-α水平與術前相比無明顯變化，但實驗組則隨著時間的推移而下降。見圖1～3。

表1 各組中各因子術前、術后3、6、9周水平的變化（±s）

表1 各組中各因子術前、術后3、6、9周水平的變化（±s）

注：與術前比較，aP＜0.05

空白對照組組別 n 因子IL-1（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（nmol/L）IL-1（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（nmol/L）IL-1（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α IL-1（pg/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（nmol/L）10單純牙周炎組10糖尿病性牙周炎組10實驗組10術前27.36±0.93 144.35±0.82 62.05±0.83 69.48±0.69 300.70±1.21 187.70±0.61 89.64±1.11 394.31±0.57 196.67±0.90 90.05±1.05 400.14±1.07 200.95±1.43術后3周26.95±0.81 144.28±0.93 61.77±1.01 70.12±0.84 300.52±1.46 187.17±1.53 89.33±1.06 393.85±1.24 196.41±0.82 75.91±1.21a 333.23±1.67a 181.54±1.22a術后6周27.13±0.76 143.95±0.76 61.90±0.78 69.82±0.77 300.78±1.31 187.64±1.35 89.44±1.35 394.28±0.67 196.38±0.75 59.97±1.75a 255.61±1.89a 105.53±0.64a術后9周27.65±0.68 144.04±0.68 61.54±0.91 69.75±0.85 300.69±1.60 187.92±0.87 89.96±0.99 394.35±1.09 196.07±0.77 32.72±1.70a 161.96±1.24a 82.57±1.04a

表2 球形檢驗結果

表3 個體內變異部分的計算結果

表4 個體間變異部分的計算結果

圖1 各組各個時點重復測量IL-1水平的均數變化趨勢圖

圖2 各組各個時點重復測量IL-6水平的均數變化趨勢圖

圖3 各組各個時點重復測量TNF-α水平的均數變化趨勢圖

3 討 論

2型糖尿病不僅是一種代謝性疾病，也是一種自然免疫和亞臨床炎癥疾病，其發病機制與慢性低度炎癥密切相關[5]。而促炎因子TNF-α、IL-6及IL-1與胰島素抵抗和代謝綜合征密切相關[6]，是糖尿病及其慢性并發癥的重要發病基礎。而在2型糖尿病牙周炎患者中也發現齦溝液中的 IL-8、IL-6、TNF-α、IL-1β 等水平明顯比單純牙周炎患者高[7]。說明炎癥在牙周炎和糖尿病的發生發展中均起著重要作用。

二甲雙胍是臨床上常用的降糖藥，同時也具有抗感染作用，其直接作用于腺苷三磷酸活化的蛋白激酶，在調節脂多糖誘導的IL-1β、IL-6、TNF-α等相關炎癥因子的表達過程中起著重要作用[8-9]。本研究發現，在術前，實驗組和糖尿病性牙周炎組大鼠的IL-1、IL-6和TNF-α水平最高，其次是單純牙周炎組，最低是空白對照組。說明糖尿病和牙周炎均可使大鼠的IL-1、IL-6和TNF-α水平升高，而且糖尿病和牙周炎的致炎作用尚有疊加作用。空白對照組、單純牙周炎組、糖尿病性牙周炎組大鼠術后3、6、9周的IL-1、IL-6和TNF-α水平與術前相比無明顯變化，但實驗組則隨著時間的推移而下降。說明二甲雙胍在其中起到了抑制炎癥的作用，其機制可能在于二甲雙胍下調了脂多糖誘導的IL-1、IL-6和TNF-α的分泌，具有直接的抗感染作用[10]。牙槽骨吸收是牙周炎的最終結局，骨改建的調節因子主要是IL-1和TNF-α，其可促進骨的吸收，因此，抑制了炎性反應就可抑制牙槽骨吸收的速度[11]。

綜上所述，在糖尿病性牙周炎中IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平增高，而二甲雙胍既可以有效地調節血糖，還可以改善由脂多糖引起的成骨異常，對骨組織起到一定的保護作用[3]。

[1]CAIRO F，ROTUNDO R，FRAZZINGARO G，et al.Diabetes mellitus as ariskfactorforperiodontitis[J].MinervaStomatol，2001，50（9/10）：321-330.

[2]TAYLOR GW，BORGNAKKE WS.Periodontal disease：associations with diabetes，glycemic control and complications[J].Oral Dis，2008，14（3）：191-203.

[3]SCHURMAN L，MCCARTHY AD，SEDLINSKY C，et al.Metformin reverts deleterious effects of advanced glycation end-products（AGEs）on osteoblastic ceils[J].Exp Clin Endoerinol Diabetes，2008，116（6）：333-340.

[4]ISODA K，YOUNG JL，ZIRLIK A，etal.Metformin inhibits proinflammatory responses and nuclear factor-kappaB in human vascular wall cells[J].Arterioscler Thromb Vase Biol，2006，26（3）：611-617.

[5]DONATH MY，B?NI-SCHNETZLER M，ELLINGSGAARD H，et al.Islet inflammation impairs the pancreatic beta-cell in type 2 diabetes[J].Physiology（Bethesda），2009，24：325-331.

[6]TILG H，MOSCHEN AR.Insulin resistance，inflammation，and nonalcoholic fatty liver disease[J].Trends Endocrinol Metab，2008，19（10）：37l-379.

[7]DUARTE PM，BEZERRA JP，MIRANDA TS，et al.Local levels of inflammatory mediators in uncontrolled type 2 diabetic subjects with chronic periodontitis[J].J Clin Periodontol，2014，41（1）：11-18.

[8]PEAIRS A，RADJAVI A，DAVIS S，et al.Activation of AMPK inhibits inflammation in MRL/lpr mouse mesangial cells[J].Clin Exp Immunol，2009，156（3）：542-551.

[9]GIRI S，NATH N，SMITH B，et al.5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranoside inhibits proinflammatory response in glial cells：a possible role of AMP-activated protein kinase[J].J Neurosci，2004，24（2）：479-487.

[10]范梅琳，劉云峰，章毅，等.二甲雙胍對脂多糖誘導的THP-1細胞相關炎癥因子及凋亡的影響[J].中華內分泌代謝雜志，2013，29（9）：801-805.

[11]LIU R，BAL HS，DESTA T，et al.Diabetes enhances periodontal bone loss through enhanced resorption and diminished bone formation[J].J Dent Res，2006，85（6）：510-514.