偽狂犬病及其根除：美國經(jīng)歷的回顧—監(jiān)測和病例發(fā)現(xiàn)

譯校│陳慧娟 穆佳毅 李琦（中國動物疫病預(yù)防控制中心）

監(jiān)測是豬群的疾病狀況、特點或狀態(tài)信息的常規(guī)收集方法。收集此類信息的目的在于發(fā)現(xiàn)影響豬群的傳染病學(xué)參數(shù)的變化。之后，對收集的數(shù)據(jù)進行分析，以便讓獸醫(yī)處官員計劃并采取適當?shù)男袆樱_保美國動物衛(wèi)生安全。

和所有的動物疾病根除計劃一樣，病例發(fā)現(xiàn)與監(jiān)測是偽狂犬病毒（PRV）計劃的重要組成部分。此類活動應(yīng)確定PRV的出現(xiàn)是否受到新的因素的影響。實施的監(jiān)測方法能夠發(fā)現(xiàn)感染豬群中的PRV陽性動物。計劃官員也是通過抽樣監(jiān)測豬群，確保豬群為陰性。

PRV根除計劃采用六種采樣方法監(jiān)測商品豬群。一些州還監(jiān)測野生豬群將PRV傳播至商品豬的風險。計劃官員在決定采取何種抽樣方法時，必須考慮到多種因素。這些因素包括：根除計劃的階段、可用于收集樣本的經(jīng)過培訓(xùn)的員工數(shù)量、可用于收集和檢測標本的資金量、實驗室的標本檢測能力、豬群中預(yù)計的流行率、收集樣本的目的。

在大多數(shù)病例中，組合的抽樣方法可提供最佳信息。比如，在豬密度高且流行率高的地區(qū)，資金可更好地用于快速查找新病例。在預(yù)計有新暴發(fā)的地區(qū)，隨機選擇豬群進行檢測，向動物提供平等的機會，并隨時監(jiān)測發(fā)病率可能是更穩(wěn)健的方法。這項長期疾病監(jiān)測可用于提供關(guān)于計劃有效性的信息。

一、地區(qū)檢測

特定時期內(nèi)，在指定地區(qū)內(nèi)對所有豬群進行采樣被稱為地區(qū)檢測或“路邊檢測”（DTR）。這些地區(qū)被規(guī)定為州內(nèi)的縣、鎮(zhèn)或區(qū)域。地區(qū)內(nèi)的豬群首先由最熟悉該地區(qū)的個人進行確認，比如豬肉生產(chǎn)商、縣推廣教育負責人或獸醫(yī)。由于PRV血清檢測被認為具有接近100%的敏感率和特異率，計劃官員決定，使用的統(tǒng)計學(xué)抽樣方法將滿足在陽性豬群中至少發(fā)現(xiàn)一個PRV陽性樣本的需要。

在伊利諾伊州PRV試點項目實施之前和期間，州官員檢測小部分種豬，確定與從豬群中轉(zhuǎn)移種豬相關(guān)的疾病風險。這一小部分包括檢測由最多10頭豬組成的種豬群中的所有豬，由11～35頭豬組成的豬群中的10頭豬，以及至少由36頭豬組成的豬群中30%的豬（最多30頭）。之后，其他州使用統(tǒng)計學(xué)公式計算抽樣量，根據(jù)不斷變化的流行率、豬群規(guī)模和選定的概率確定樣本數(shù)量。

在地區(qū)檢測中，經(jīng)常會使用州-聯(lián)邦-行業(yè)計劃標準中的官方隨機標本檢測，也就是“95/10檢測”。若預(yù)計的PRV血清流行率至少為10%，且發(fā)現(xiàn)至少一個血清陽性動物的把握為95%，則下面的抽樣集決定了從豬群中抽樣檢測的數(shù)量：若豬群規(guī)模低于100頭，則對25頭豬進行取樣；若豬群規(guī)模在100～200頭，則對27頭豬進行取樣；若豬群規(guī)模在201～999頭，則對28頭豬進行取樣；若豬群的規(guī)模至少為1000頭豬，則對29頭豬進行取樣。為了讓這一子集在統(tǒng)計學(xué)上具備有效性，且能夠準確地確定豬群的PRV資格，樣本收集者必須隨機選擇動物，或確保組內(nèi)的動物有同樣的概率進行檢測。只要種豬的后代為隔離飼養(yǎng)，這些生長育肥豬就被視為獨立的豬群。這樣的抽樣能準確預(yù)測豬群的PRV資格，因為大多數(shù)感染豬群的血清流行率都高于10%。

在許多豬群都接種了PRV疫苗，且PRV陽性豬群數(shù)量較少的州內(nèi)，上述統(tǒng)計學(xué)方法以滿足95/5標準的官方隨機檢測為基礎(chǔ)。計劃官員將從豬群中收集額外的標本，確保在預(yù)期血清流行至少為5%的情況下有95%的把握檢測出至少一個陽性的動物。95/5的抽樣集包括：在數(shù)量低于100頭的豬群中，對45頭豬進行取樣；在數(shù)量為100～200頭的豬群中，對51頭豬進行取樣；在數(shù)量為201～999頭的豬群中，對57頭豬進行取樣；在數(shù)量至少為1000頭的豬群中，對59頭豬進行取樣。

采用地區(qū)檢測有諸多優(yōu)勢。在檢測結(jié)果出來后，計劃官員將盡快確定豬群的PRV狀態(tài)。此外，他們可確定并記錄動物在標本收集時的身份和類型。在標本采集時，已知動物的疫苗狀態(tài)和在動物身上采用的疫苗品牌。若檢測結(jié)果為疑似，可重新進行檢測，或安排豬群的采樣間隔時間。此外，即便標本來自于不同的大型豬群，其采樣的數(shù)量也可預(yù)測。這有助于計劃官員更準確地估計預(yù)算和實驗室能力需求。該方法也允許從不同的年齡段的動物中進行取樣。在某些情況下，以服務(wù)費來雇傭執(zhí)業(yè)獸醫(yī)從其客戶的豬群中收集標本（見圖1）。該抽樣方法在PRV流行率高、疫苗使用率高以及豬的密度高的地區(qū)得到了令人滿意的結(jié)果。

◎圖1 收集血液樣本用于PRV檢測

與此同時，計劃官員在采用地區(qū)檢測時發(fā)現(xiàn)了一些不足。首先，由于需要向標本采集者支付費用，包括驅(qū)車前往農(nóng)場、花時間限制動物、記錄信息和收集血液樣本，收集樣本的總成本更高。其次，地區(qū)檢測的結(jié)果僅代表這個時間段的參考，因為豬群的狀態(tài)由當日采集的樣本決定。雖然鼓勵對動物進行隨機采樣，但豬群所有者可能拒絕提供豬群進行檢測，除非有規(guī)定強制采樣。

二、第一點檢測

在動物運輸和所有權(quán)發(fā)生改變的第一點采集標本被稱為第一點檢測。只要種豬從豬群中轉(zhuǎn)移出，并出售至屠宰場或牲畜拍賣市場，則所有權(quán)發(fā)生改變。一些州選擇在這些市場所在地來收集血液樣本。該策略提供了定期對來自多個豬群的豬進行采樣的方法，這些豬群集中到相對較少的集中點。

第一點檢測有諸多優(yōu)勢。首先，該方法可以在豬離開來源豬群后立即進行檢測。其次，計劃官員可在銷售之時獲得來源豬群的準確身份。第三，可使用記錄系統(tǒng)控制每年從各個農(nóng)場收集的樣本數(shù)量。第四，由于動物在樣本采集前只會在銷售渠道中停留較短的時間，動物不太可能從來自其他豬群的被感染的豬接觸后發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。第五，由于從一個地方的來自多個豬群的動物身上采集樣本，勞動力成本更低。因此，第一點檢測同以每個豬群為基礎(chǔ)的地區(qū)檢測相比，成本更低。最后，該方法可發(fā)現(xiàn)此前計劃官員未列出的豬群。

第一點檢測也有一些不足。比如，需要雇傭額外的員工在上述市場上收集樣本。另一個不足就是在收集樣本時不太可能獲得動物的疫苗狀態(tài)。此外，第一點檢測可能會對大型種豬群進行過度取樣，在小型種豬群中又取樣不足，這主要是因為各類豬群中出售動物的頻率不同。該方法同樣還需要對來源豬群進行額外追蹤和檢測，然后才能確定豬群的狀態(tài)。最后，采用這種方法，對達到上市體重的豬進行取樣的可能性較低，因為這類豬通常會被直接從農(nóng)場運送至食品加工廠。因此，除非鄰近的州也采用同樣的樣本收集方法，否則無法對運送至鄰近幾個州的市場上的豬進行取樣。

三、屠宰監(jiān)測

當豬在屠宰場處理期間收集標本的方法被稱為屠宰監(jiān)測或商品豬監(jiān)測。來源豬群剔除種豬后直接被交付至豬市場或食品加工廠。在這兩種情況下，每頭豬都有防水標識的標簽，每個標簽都有獨立的編號。標簽粘貼到每頭豬背部的皮上。由于標簽在動物身上的位置，標識標簽也被稱為“背上標簽”（見圖2）。

◎圖2 帶有背部標簽的選擇性宰殺母豬

根據(jù)每個帶編號的標簽或標簽系列來記錄動物的所有者。在動物放血時，收集并保留血液標本和標識標簽。實驗室將檢測為陽性的標本及其標簽編號報告至市場所在州的官員。計劃官員使用市場保留的記錄進行追溯，一旦確定豬群來源，計劃官員開展調(diào)查確定從該豬群的動物中收集多少額外的血液樣本。然后，他們使用檢測結(jié)果來確定豬群的PRV狀態(tài)。

和其他監(jiān)測方法一樣，在屠宰場收集標本有諸多優(yōu)勢。其中最明顯的優(yōu)勢就是，收集每個標本的成本低于其他任何收集方法。此外，在一整年中，來自于同一豬群的豬可能會被多次采樣，提供了在一整年內(nèi)監(jiān)控豬群的機會。屠宰場監(jiān)測的另一個重要優(yōu)勢就是，能夠?qū)λ羞\至屠宰場的帶仔種豬群進行檢測。只要遵照背部標簽的程序，且標簽一直固定在豬皮上直到計劃官員采集標本和標識標簽。最后，這種方法能夠監(jiān)測到計劃官員未列出的種豬群。

屠宰場監(jiān)測也有一些劣勢。首先，這種方法需要精確地放置背上標簽，保持準確的記錄，充分地留存標識標簽。屠宰場監(jiān)測也需要聯(lián)系第三方（不受雇于監(jiān)管機構(gòu)或豬的所有者）來檢查記錄，并報告與樣本匹配的標識編號的所有者姓名。此外，計劃官員在完成對來源農(nóng)場的調(diào)查之前，無法得知豬群的PRV免疫狀態(tài)。而且，將動物追蹤至正確的來源豬群取決于標識標簽和血液標本在食品加工廠和實驗室的精準配對。

屠宰場監(jiān)測的另外一些劣勢包括：由于在采樣時豬群的PRV狀態(tài)是未知的，計劃官員可能會采集和檢測了比其他方法更多的樣本，并且還需要額外的費用來追蹤和調(diào)查已知被感染的豬群，這是因為送至屠宰場的感染PRV的種豬重復(fù)出現(xiàn)陽性標本。樣本的質(zhì)量可能更低，在夏季送到實驗室時的狀態(tài)不夠理想。商品豬并不在接收種豬的屠宰場進行處理，因此不包括在這一類的屠宰場監(jiān)測中。但是，在后來在監(jiān)測計劃中制定了對這些商品豬進行采樣的方法。見本文“六、肌紅蛋白監(jiān)測”部分，該部分講述了在其他屠宰場對商品豬進行采樣的方法。

四、診斷實驗室檢測

另一種對豬群進行PRV監(jiān)測的方法是檢測從病豬或瀕死的豬身上采集并提交至實驗室的樣本（見圖3）。在計劃早期就確立了這種發(fā)現(xiàn)PRV病例的方法。如果獸醫(yī)懷疑其客戶的豬群中有疑似PRV病例，將提交標本并要求進行疾病檢測。許多州要求獸醫(yī)和診斷實驗室向州級獸醫(yī)報告PRV監(jiān)測為陽性的病例。在根除計劃后期，PRV檢測申請出現(xiàn)的頻率更低。隨著技術(shù)的進步，出現(xiàn)了更多的檢測方法——例如免疫組織化學(xué)和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCV），用來發(fā)現(xiàn)病原的存在。在使用這些新的檢測方法后，實驗室很少使用細胞培養(yǎng)分離病毒進行診斷。因此，除非疾病排除清單上專門包括了PRV，否則可能不會進行專門的PRV檢測。

◎圖3 對在診斷實驗室中可能涉及PRV的病例保持警戒

為了應(yīng)對PRV診斷檢測率的下降，幾個州制定了監(jiān)控計劃，為實驗室的診斷專家提供PRV的病例定義和資金，用于從提交的PRV疑似病例的組織上進行直接熒光抗體檢測和確認PCR。計劃還允許對田間病例提交的最多五個血清樣本上進行PRV檢測。這類監(jiān)控給計劃官員帶來了一個重要的好處——可以用PRV相似臨床癥狀的病例為目標。實驗室能夠發(fā)現(xiàn)涉及PRV的臨床病例，如果在提交診斷標本時未要求進行PRV檢測，則有可能錯過這些病例。同所述的其他任何監(jiān)測方法相比，這種以PRV疑似病例為目標的方法可以讓計劃官員在臨床暴發(fā)之初以最快的速度發(fā)現(xiàn)PRV。此外，PRV計劃的成本也降至最低，因為已經(jīng)為其他原因而收集標本，計劃只需支付PRV檢測的費用。

在診斷實驗室監(jiān)控PRV的主要劣勢是采集和檢測的標本多為便利標本。PRV感染豬群畜主擔心發(fā)現(xiàn)病例或可能的檢疫隔離，因此可能選擇不提交樣本。此外，小規(guī)模的農(nóng)場財力資源有限，可能因為成本而不將樣本提交至診斷實驗室。因此，在使用這一疾病監(jiān)控方法期間可能會錯過PRV病例。

五、豬群認證檢測

在整個PRV計劃期間都會進行檢測來保持已知為陰性的豬群的狀態(tài)，或在各州之間運輸或運至展覽的個體動物的陰性狀態(tài)。雖然陰性豬群狀態(tài)和個體動物檢測通常不包括在監(jiān)控或監(jiān)測方法中，但結(jié)果提供了部分有用信息。

PRV監(jiān)控架子豬群、合格的PRV陰性豬群（QN）和合格的疫苗接種陰性豬群（QNV）等術(shù)語向這些豬群的購買者保證，已定期完成PRV檢測，且結(jié)果為陰性。這對希望能確保購買到的牲畜不受PRV感染的種豬或架子豬的購買者尤其有利。若種豬并非來自QN或QNV豬群，需要對出售的每頭豬進行采樣并檢測為陰性。對經(jīng)常出售大量種豬的豬群所有者而言，個體動物檢測不僅不方便，而且成本太高。重復(fù)的陰性PRV檢測記錄有助于買家和監(jiān)管官員相信這些豬群未被感染，且來自這些豬群的豬不可能向其他豬群傳播PRV。

六、肌紅蛋白檢測

在全國PRV根除計劃啟動后，美國生豬行業(yè)經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)實踐上的最大變革。1989年之前，絕大多數(shù)農(nóng)場都位于一個地點，或者都是在本地的生產(chǎn)業(yè)務(wù)，種豬和育肥豬之間有密切接觸，接受同樣的日常管理。種豬位于所有主要的生產(chǎn)地區(qū)內(nèi)。因此，檢測定點的種豬群能夠為所有類型的豬提供診斷參考。隨著多地飼養(yǎng)和早期斷奶生產(chǎn)的建立，地理上分散的農(nóng)場和豬的集中生產(chǎn)成為規(guī)范。育種和保育工作轉(zhuǎn)移到此前豬密度較低的地區(qū)，而育肥地聚集在鄰近的地理地區(qū)，促進飼養(yǎng)、銷售、運輸和管理控制。由于這些變化，集中程度較高的大型肥育豬群所在地區(qū)內(nèi)沒有了已經(jīng)在監(jiān)測計劃下的PRV標記種豬。在愛荷華州、密蘇里州、明尼蘇達州和威斯康星州的傳統(tǒng)架子豬來源被來自北卡羅來納州、佐治亞州、俄克拉荷馬州、科羅拉多州和加拿大的斷奶豬代替。在20世紀90年代，每天都會建成新的育肥場點設(shè)施，但是當?shù)貏游镄l(wèi)生官員很少知道。因此，對于大量豬的移動，沒有監(jiān)管設(shè)備來監(jiān)控PRV計劃的進度。這些情況并非愛荷華州特有，已被復(fù)制到整個美國中西部、東南部的州和西南部的平原，以及加拿大西部平原的更小范圍內(nèi)。

與其育種區(qū)在地理上無關(guān)聯(lián)的大量育肥豬的出現(xiàn)形成了PRV監(jiān)測的真空區(qū)。檢測為陰性的種豬群和架子豬（跨州或在州內(nèi)）運送至育肥地后受了當?shù)氐臍馊苣z傳播或生物安全措施被破壞后其他途徑的感染，持續(xù)成為未被發(fā)現(xiàn)的PRV感染儲主。依靠傳統(tǒng)的種豬和移動檢測來確定地區(qū)的PRV狀態(tài)的意義降低。通過DTR檢測監(jiān)控這些豬群同樣也受限，原因在于涉及的運送量和頻率。在沒有主動的商品豬監(jiān)測系統(tǒng)的情況下，可能（實際上也確實）存在未被發(fā)現(xiàn)的重要PRV宿主。

2000年，愛荷華州立大學(xué)（ISU）的一位研究員提出了一項試點商品豬項目，通過肌紅蛋白技術(shù)評估被感染豬群中的PRV抗體，正如此前在丹麥沙門氏菌控制計劃中制定和實施的方法。肌紅蛋白是肉類標本在冷凍后釋放出的液體，可在常溫下融解，包含抗體和其他細胞外和細胞內(nèi)的材料，反映出臨死動物的狀態(tài)。

在從胴體中取出內(nèi)臟后即可使用肉標本，實現(xiàn)了標本采購的靈活性，可在安全衛(wèi)生的環(huán)境下獲得，且不會對胴體的價值造成實質(zhì)性影響（見圖4～5）。屠宰場通常使用批次標識（印章、批次號）用于生產(chǎn)商付款。因此，該標識方法被認為是標本采購和追蹤的最佳選擇（見圖6）。該方法是此前州或聯(lián)邦的監(jiān)管機構(gòu)和生產(chǎn)商監(jiān)督認證的機制。

同樣是在2000年，ISU的研究人員同美國農(nóng)業(yè)部的PRV根除加速項目合作，對196對血清和肌紅蛋白標本進行初步檢測，這些標本來自于4個感染PRV豬群中的育肥豬。這四個豬群中既有陰性，也有陽性血清值。

◎圖4 從隔膜的柱狀物上收集豬肉標本

◎圖5 密封在容器內(nèi)的豬肉標本，標有標本編號。將連夜冷凍，然后解凍，得到用于檢測的肌紅蛋白

◎圖6 豬尸體上的印章（照片增強），確定尸體的所有者

從冷凍和解凍肉標本得到肌紅蛋白，使用IDEXX HerdChek ELISA-gpE血清方法檢測標本。血清和肌紅蛋白使用同樣的陰性-陽性判定標準，肌紅蛋白標本不再進行進一步的處理。個體比較結(jié)果顯示，196頭接受檢測的豬中，血清和肌紅蛋白標本之間的一致性達到97%。除了6頭豬外，所有的豬的分類都與配對的標本一致。這6頭豬的血清呈陽性，肌紅蛋白為5個疑似和1個陰性。基于這一數(shù)據(jù)，基于個人興趣形成了一個包括州和聯(lián)邦監(jiān)管官員、州和國家豬肉生產(chǎn)商代表，以及ISU獸醫(yī)學(xué)院在內(nèi)的特別小組，其目標是為試點計劃爭取更多的支持。根據(jù)特別小組的考慮和對病例查找項目必要特征的構(gòu)想，州和聯(lián)邦的PRV官員批準了三個月的試點項目來確定肌紅蛋白技術(shù)作為商品豬監(jiān)測工具的潛力。

項目領(lǐng)導(dǎo)者尋求肉類企業(yè)主的合作，獲得標本和數(shù)據(jù)所有權(quán)，在ISU CVM建立處理實驗室。2001年3月，第一批的3家肉類企業(yè)開始采樣并報告每天每一批豬的來源。ISU的獸醫(yī)診斷實驗室分析此類標本，報告所有的陽性結(jié)果至愛荷華州的獸醫(yī)進行評估和追蹤。根據(jù)其有效性的早期證據(jù)，該試點項目在三個月內(nèi)擴大至愛荷華州的8個主要屠宰場，代表了約25%全國商品豬日屠宰能力。生產(chǎn)商識別數(shù)據(jù)顯示，在接受采用這一方法的PRV監(jiān)控豬群中，約66%來自于愛荷華州，剩余的豬群追蹤到鄰近的10個州，主要為7個鄰近的州。2001年3月～10月，試點項目在愛荷華州共發(fā)現(xiàn)13個新感染的場點。2000年和2001年，愛荷華州處于第二階段的縣進行了半年的廣泛DTR檢測，期間并未發(fā)現(xiàn)這些陽性場點。特別小組的成員根據(jù)試點項目的調(diào)查結(jié)果修改了采樣率，因為計劃的需求從病例發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移至地區(qū)監(jiān)測。

在之后的三年內(nèi)，動物衛(wèi)生官員在愛荷華州使用市場或其他監(jiān)測方法并未找到新的被感染的豬群。這證明了商品豬監(jiān)測在病例尋找和地區(qū)監(jiān)測方面的價值。隨后的研究證明，肌紅蛋白是一種令人滿意的抗體檢測介質(zhì)，可發(fā)現(xiàn)豬中一系列的病毒、細菌和寄生生物。這些市場檢測技術(shù)為一系列的抗體檢測項目提供了數(shù)據(jù)，有助于未來控制、根除或認證計劃的開發(fā)和監(jiān)控。

七、野生豬監(jiān)測

有野生豬的州可能存在PRV儲主，繼續(xù)成為將PRV引入商品豬的風險因素。在其中的幾個州，動物衛(wèi)生官員制定了監(jiān)控和監(jiān)測方法評估這一風險。此類監(jiān)控計劃的實施是該州野生豬管理計劃的一部分。計劃包括對野生豬和商品豬群進行取樣，這些豬群在戶外飼養(yǎng)且可能接觸到有報告病例的地區(qū)內(nèi)的野生豬。各州的自然資源部門和各州的農(nóng)業(yè)部門鼓勵積極誘捕和狩獵計劃，指導(dǎo)捕獸者或狩獵者就野生豬的捕殺向監(jiān)管官員提供警示。只要有可能，州或聯(lián)邦官員獲得血液或組織標本后會將其提交至診斷實驗室進行PRV檢測。由于戶外飼養(yǎng)的豬群有直接接觸野生豬的風險，因此選擇其進行地區(qū)檢測來重新確定PRV的狀態(tài)。此外，長期存在野生豬的州認識到，野生豬有時會被當作架子豬捕獲和出售。這些州了解商品豬和捕獲野生豬之間的聯(lián)系和可能在市場上存在的接觸。因此，一些州啟動了第一點檢測來發(fā)現(xiàn)這些市場上可能通過與野生豬的接觸而感染PRV的野生豬或馴養(yǎng)豬。

總而言之，監(jiān)管官員使用一系列的方法來收集標本用于PRV監(jiān)測或?qū)ふ也±Ｈ缟纤觯鞣N方法都有一些優(yōu)勢和劣勢。總體而言，各州能夠根據(jù)其豬的數(shù)量、流行率、可用資金和個體目標來選擇方法組合。