遼寧省朝陽市豬流行性腹瀉病原學調查

文│蔡洪波（遼寧省建平縣八家農場動物衛生監督所）

為了解遼寧省朝陽市豬流行性腹瀉的病原在季節及各個日齡的感染強度，分別采集34份血清和63份病料樣品，應用RT-PCR和試紙條檢測方法對病料樣品和血清進行病毒核酸和抗原檢測。結果顯示，豬流行性腹瀉在遼寧省朝陽市的各個季節和各個日齡階段均有感染，但在氣候偏寒冷的冬季容易感染和發病，主要侵害30日齡以內的哺乳仔豬，其病毒核酸陽性率高達71.4%，血清抗原陽性率高達43.2%。因此，應針對以上情況，對豬場全面采取免疫接種、消毒、環境營養控制等生物安全管理措施，尤其是在寒冷季節針對哺乳仔豬進行重點防控。

一、材料與方法

1.材料。

（1）檢測樣品。在遼寧省朝陽市各大養殖豬場戶，分不同時間和不同日齡進行全面隨機采集有腹瀉癥狀的豬糞便或發病死亡豬腸道樣品、血清。糞便和腸道內容物樣品用于RTPCR病毒基因檢測，血清樣品用于金標試紙病毒抗原檢測。上述樣品采集于發病流行期間，時間為2016年4月～2017年3月。

（2）試劑盒來源。豬流行性腹瀉病毒一步法RT-PCR診斷試劑盒，即為反轉錄酶（M_MLV）、RNA酶抑制劑由Promega公司生產。RT-PCR試劑（10×Buffer，d-NTP s，TaqDNA聚合酶等）均購自TaKaRa公司。引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。豬流行性腹瀉抗原檢測金標試紙條由山東綠都生物科技有限公司生產，批號為LD-Z01。

（3）主要儀器和用品。儀器：PCR儀GT9612，鄭州市金水區南北儀器儀表商行；電泳儀JY1600C通用型，深圳市科昊實驗設備有限公司。

用品：包括金標試紙條、洗板、槍頭、EP管、量筒、容量瓶、勻漿器、剪刀、鑷子等。

2.方法。

（2）RT-PCR檢測。將制成的模板RNA解凍或現用，引物、酶、dNTP、混合液ddH2O在室溫（15～25℃）解凍備用。

PCR反應步驟：變性、退火和延伸。在PCR管中按順序添加5×Taq聚合酶buffer（包含引物）、dH2O、酶（Taq聚合酶 ）、dNTP、M2+加樣本模板對照DNA。

電泳鑒定，進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

（3）金標紙抗原檢測。豬流行性腹瀉病毒應用豬流行性腹瀉抗原檢測金標試紙條進行檢測。

（4）豬場防控管理措施。根據豬流行性腹瀉的病原學調查結果，對規模化養豬場制定了嚴格生物安全管理措施，其中包括豬場飼養管理制度、飼料營養、環境衛生、無害化處理、消毒制度、生物藥物保健、免疫接種和疫病監測技術規程。選擇朝陽市建平縣華晨種豬場進行應用試驗。

表1 病料樣品采集份數

表2 血清樣品采集份數

（5）統計學方法。所得數據采用SPSS 16.0軟件進行卡方檢驗。

二、結果與分析

1.病料樣品、血清樣品采集數量。不同時間、日齡采集病料樣品、血清樣品份數見表1～2。

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2.RT-PCR檢測結果。63份豬流行性腹瀉病毒病料樣品在不同時間、日齡下RT-PCR檢測結果見表3。由表得知，易感豬群在1～30日齡偏高（P＜0.01）；2016年10～11月，病毒核酸陽性率為62.5%，2017年1～3月，病毒核酸陽性率為71.4%，明顯高于其他兩個季度（P＜0.01）。

3.血清檢測結果。34份豬流行性腹瀉病毒血清樣品在不同時間、日齡檢測結果見表4。由表得知，1～30日齡抗原陽性率偏高（P＜0.01）；2016年10～11月，抗原陽性率為40.1%，2017年1～3月，抗原陽性率為43.2%，高于其他季度時間（P＜0.01）。

三、討論

1.豬流行性腹瀉病毒主要感染情況。上述實驗的結果表明，豬流行性腹瀉病毒在遼寧省朝陽市分布較為廣泛，在各季節均有感染，但1～3月感染率較高，說明在氣候偏寒冷的季節感染率和發病率都很高。1月齡以內的哺乳仔豬感染率和病死率最高，育肥豬和成年豬感染率較低，也容易恢復。豬流行性腹瀉抗原檢測金標試紙條檢測結果和基因檢測結果一致，其操作簡便、速度快、成本低，適合臨床應用。

2.豬場流行性腹瀉疾病發生的誘因。根據對朝陽市各大養殖豬場戶的豬病原學檢測結果分析，說明該病在豬場中污染嚴重，但是多發生在枯草期和寒冷時期。造成發病的誘因是季節，所以在制定防范措施的過程中，要注意保持豬圈干燥，避免潮濕陰冷，及時做好防護保護措施，還要定期檢測病原，制定相應的免疫程序，達到最佳的防治措施。

3.應用生物安全措施防治豬腹瀉性疾病。規模化養豬場養豬數量多，豬的調動頻繁，飼料周轉快，所以人員車輛出入多。場內一旦有該病原微生物感染，如防范管理措施不當就會造成重大經濟損失，而且這種病原微生物不易被消滅，可能長久危害豬場。因此，要制定完善的生物安全管理措施，并且嚴格執行才能確保養豬場健康穩定發展。

飼養管理是養殖場疫病防控的關鍵。首先，做好豬群飼料、飼喂、飲水的管理，使易感群具有抗病能力；其次，控制好豬群的調轉、車輛及人員的出入；第三，做好場舍的消毒、出入場豬的檢疫、豬舍的環境衛生、舍內的通風、控制好溫度和濕度等工作；最后，定期進行病原學檢測，飼料中投中藥保健預防，針對性做好免疫接種。做好上述綜合生物安全管理措施才能有效防控傳染病的發生。

表3 養殖豬場病毒核酸檢測結果統計陽性率（%）

表4 養殖豬場血清抗原檢測結果統計陽性率（%）

4.豬流行性腹瀉的防治。豬流行性腹瀉病毒傳播較慢，發病后對易感豬群及時免疫，應用豬胃腹二聯疫苗免疫注射，并且在每年的秋季開始免疫。

應用中藥方劑進行預防和治療，組方：白頭翁、馬齒莧、良姜、石榴皮、肉豆蔻、白術、扁豆、豬苓、厚樸（制）拌料飼喂。每天1次，連續應用30天左右。

采用交叉感染方法預防，就是把發病豬的糞便投放到妊娠母豬舍，使其產生強力的母源抗體，對仔豬產生被動保護作用。該方法經過臨床試驗，使仔豬感染推遲進而減少死亡損失，使該病的流行時間縮短。

發病豬場要徹底消毒，每天1次，連續應用，并且還要更換消毒液。對已發病豬只進行隔離，病死豬作無害化處理。

病豬要及時口服補充糖鹽水和碳酸氫鈉，防止脫水和酸中毒。病情嚴重者，采用靜脈滴注法。有條件的在飼料中添加腐殖酸鈉粉。

5.診斷豬場發病情況的便捷方法。RT-PCR技術是迄今最敏感的細胞因子檢測技術，而且可以直觀地反映淋巴細胞產生細胞因子的能力。其缺點是操作較為煩瑣，測定結果只能代表細胞因子基因的表達，而不能代表活性細胞因子的水平，并且不容易對細胞因子表達水平進行定量。

用金標試紙檢測血清抗原比較特異、方便、易標準化和批量化，很適合臨床應用。其缺點是所提供的是免疫活性信息，而不是細胞因子生物活性信息。綜上，這種方法更適用于診斷豬場發病情況。

四、結論

遼寧省朝陽市豬流行性腹瀉病毒感染分布較廣，豬流行性腹瀉病毒在各季節和各日齡階段均有感染，但在氣候偏寒冷的季節容易感染和發病，且主要侵害30日齡以內的哺乳仔豬。