c-kit突變型與野生型胃腸道間質瘤中基因表達譜的鑒定

陳 杰，王春萌，羅 鵬，楊凌舸，師英強

1. 復旦大學附屬腫瘤醫院胃外科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫院骨與軟組織外科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是消化道最常見的間葉來源腫瘤，主要發生于胃和小腸，少數發生于腹膜后、網膜和腸系膜，約占全部胃腸道惡性腫瘤的2%［1］。近年來，GIST的概念提出后，其診斷和治療有了飛速發展，這得益于GIST中特征性遺傳改變被發現c-kit基因突變［1］。目前伊馬替尼是轉移性或不可切除GIST標準的一線治療藥物［7］。但是，越來越多的研究表明，伊馬替尼在治療GIST過程中存在原發性耐藥和繼發性耐藥，且耐藥機制復雜，其中原因可能與腫瘤中存在繼發c-kit基因突變的多細胞克隆有關。因此，對于伊馬替尼原發或繼發耐藥的晚期GIST患者的治療目前仍是一個難題。在這一背景下，尋找新的致病因子及治療靶點，從而為胃腸道間質瘤的治療提供新的策略和思路顯得十分重要。

c-kit基因位于人染色體4q12-13上，編碼Ⅲ型跨膜生長因子受體。其受體蛋白由細胞內酪氨酸蛋白結構域、跨膜結構域及細胞外配體結構域共同組成。已有研究指出，c-kit在多種腫瘤中表達異常，其在多種實體腫瘤中表達上調，但在乳腺癌、黑色素瘤及甲狀腺癌中呈低表達［2］。在肝癌中，TGF-β/c-kit能夠形成一個正反饋環促進腫瘤的發生、發展［3］。但是，對于c-kit在腫瘤中的作用，我們仍然知之甚少。國內外研究表明，c-kit基因突變率為75%～80%［3］。其中最常見的是外顯子11突變(65%～70%)，以及外顯子9突變(10.0%)、外顯子13(1.7%)和外顯子17(1.3%)等少見突變位點。突變類型以缺失突變、點突變、混合突變和插入突變為主［4］。靶向藥物甲磺酸伊馬替尼治療GIST的機制在于, 當c-kit激酶激活后，使酪氨酸殘基磷酸化，從而調節細胞的生長和凋亡［5］。

除了由基因突變引起的GIST外，還有一類特殊GIST，即野生型GIST。實際這個命名并非完全準確，而是對形態學符合GIST，CD117陽性或陰性表達，同時未能檢測到c-kit和血小板源性生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)基因突變的GIST的統稱。國內外研究發現，85%的兒童GIST和10%～15%的成人GIST既沒有c-kit基因突變，也沒有PDGFRA基因突變，故被稱為野生型［6］。到目前為止，野生型GIST的發病機制仍不明確，它并非是單一的GIST種類，而是一個由生物特性迥異的多個亞群組成的家族，其基因分子發病機制也可能不完全相同，這一領域亟需進一步深入研究。

在本研究中，我們采用4對原發性GIST與相應的癌旁組織，去除核糖體RNA后，構建RNA測序文庫，采用美國Illumina公司Hiseq 2500進行雙端測序。結合生物信息分析，用TopHat2得到c-kit突變型與野生型GIST中差異表達的基因。希望通過探索c-kit突變對于GIST組織表達譜的影響，從而為研究GIST的發病機制提供新的理論依據，同時也嘗試為GIST的治療提供新的策略和思路。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

4對GIST及其癌旁組織均來自復旦大學附屬腫瘤醫院胃外科和骨與軟組織外科手術切除標本，獲取標本均得到倫理委員會的同意，并經過了嚴格病理診斷。

1.2 組織總RNA的抽提

采用TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)進行組織總RNA的抽提。每毫升TRIzol中加入200 μL的氯仿萃取，將無色上清液轉移帶一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀并以8 000×g的速率離心10 min，并用75%乙醇洗滌。棄上清液，室溫干燥RNA沉淀，用DEPC處理過H2O溶解沉淀，定量備用。

1.3 RNA測序

取3 μg總RNA，使用RiboMinus Eukaryote Kit(購自德國Qiagen公司)去除核糖體RNA，隨后用NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(購自美國NEB公司)構建RNA測序文庫。文庫質檢后，在Illumina NEX seq 500機器上進行測序。

1.4 統計學處理

差異表達基因熱圖、火山圖、GO富集分析及KEGG信號通路分析均使用R(3.3.2)軟件進行分析，分別使用gplots、ggplot2和clusterProfiler pachage完成。

2 結 果

2.1 RNA測序預測受c-kit調控的基因

我們利用RNA高通量測序結合生物信息學技術對c-kit突變型與野生型的胃腸道間質瘤組織進行大規模測序。首先，從4例c-kit野生型患者和4例c-kit突變型患者組織中抽提總RNA，并去除了其中的核糖體RNA。每個樣本都在Illumina HiSeq 2000測序儀上進行RNA測序，并產生了約60兆的讀段。利用TopHat2軟件，我們將這些讀段映射到人類參考基因組中(GRCh37/hg19)。

此外，本研究分析了其中的mRNA，分析了c-kit突變型與野生型患者中表達譜的差異，發現其中有263個基因差異有統計學意義(圖1)。c-kit突變型與野生型中表達譜的差異提示，這263個基因可能受到c-kit基因的調控。

2.2 基因富集分析

為了探討c-kit突變對于GIST的影響，本研究對上述263個基因進行了GO和KEGG通路富集分析。GO分析中將差異表達的基因按功能分為3大類：生物學過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞成分(cellular component，CC)。GO分析結果顯示，這263個基因顯著富集于組蛋白分解過程、蛋白激酶激活劑及T細胞受體信號小體中(圖2，表1)。c-kit突變型與野生型GIST組織中，差異基因在KEGG數據庫中富集于Hedgehog信號通路、FoxO信號通路、過氧化物酶體、膽汁酸合成以及谷氨酰胺和谷氨酸的代謝通路中(圖2，表2)。

圖 1 c-kit 突變型與野生型的胃癌組織中差異表達基因Fig. 1 Differentially expressed genes of c-kit mutant and wild type GIST tissues

圖 2 GO和KEGG通路分析Fig. 2 GO and KEGG pathway analysis

表 1 表達差異的基因功能Tab. 1 The functions of the expression-differentiated genes

表 2 KEGG通路數據庫富集分析Tab. 2 The enrichment analysis of KEGG pathway database

3 討 論

GIST能夠發生在消化系統中的許多位置，是最常見的胃腸道間葉源性腫瘤，常發生于腸系膜、胃等組織中，少量發生于十二指腸和直腸中。受體酪氨酸激酶c-kit和PDGFRA的突變被認為是GIST的主要發病因素和推動因素［1,4］。在GIST中c-kit具有高頻突變，其中常見的是第11號外顯子、第9號外顯子和第17號外顯子［5］。c-kit編碼的蛋白產物CD117的發現提供了一個更加敏感和特異的診斷指標［6］。基因突變類型能夠決定靶向藥物治療的敏感性。因此，一般推薦對患者術后的GIST標本進行常規基因檢測。c-kit和PDGFRA的突變信息能夠顯著提升我們對于患者預后信息的判斷。在c-kit發生高頻突變患者中更容易發生復發轉移，也具有更差的無瘤生存［7］。同時，c-kit能夠作用GIST的治療靶點。隨著GIST靶向治療的廣泛開展，c-kit基因突變與靶向治療的關系已基本達成共識。研究最為集中的是GIST患者基因突變類型與目前最常用的一線靶向治療藥物伊馬替尼。伊馬替尼可通過競爭性結合受體酪氨酸激酶的ATP結合位點，抑制c-kit和PDGFRA的自身磷酸化，進而抑制c-kit和PDGFRA下游信號分子的異常激活。所以，通過了解c-kit在GIST分子層面上的影響，對進一步闡明GIST發生和GIST靶向治療機制具有至關重要的作用［8］。

本研究對4例有c-kit突變和4例沒有c-kit突變的GIST組織進行測序，尋找其背后的差異基因。發現有263個基因在這兩組患者腫瘤組織中有顯著性差異。其中，170個基因在野生型患者組織中的表達量高于c-kit突變型患者組織；而93個基因由于c-kit突變而得到上調。利用這些基因分析c-kit突變引起的細胞信號通路與功能變化，進行GO分析，發現這些差異表達的基因廣泛參與組蛋白mRNA代謝、組蛋白去甲基化、內質網應激及JNK信號通路等。KEGG信號通路分析發現，c-kit引起的差異表達基因富集在Hedgehog、FoxO信號通路及谷氨酰胺、谷氨酸代謝通路中。許多腫瘤的發生、發展伴隨著如Hedgehog或FoxO信號通路的變化；反之，這些信號通路的變化也能調控腫瘤的發生、發展［9-10］。本研究提示，c-kit在GIST發生中具有一定的作用，但仍有許多問題亟待解決。在GIST中，c-kit的具體作用機制仍然需要更多的分子生物學實驗與動物模型進行詳細驗證。

［1］ HIROTA S, ISOZAKI K, MORIYAMA Y, et al. Gain-offunction mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors［J］. Science, 1998, 279(5350): 577-580.

［2］ LESSI F, FRANCESCHI S, TANTILLO E, et al. Loss of c-kit in thyroid cancer cells: a functional study to investigate its role in tumor differentiation and progression［J］. Euro J Cancer,2016, 61: 82-83.

［3］ ROJAS A, ZHANG P, WANG Y, et al. A positive TGF-β/c-kit feedback loop drives tumor progression in advanced primary liver cancer［J］. Neoplasia, 2016, 18(6): 371-386.

［4］ HEINRICH M C, CORLESS C L, DUENSING A, et al.PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors［J］. Science, 2003, 299(5607): 708-710.

［5］ LASOTA J, XI L, COATES T, DENNIS R, et al. No KRAS mutations found in gastrointestinal stromal tumors (GISTs):molecular genetic study of 514 cases［J］. Mod Pathol, 2013,26(11): 488-1491.

［6］ BEHAM A W, SCHAEFER I M, SCHüLER P, et al.Gastrointestinal stromal tumors［J］. Int J Colorectal Dis,2012, 27(6): 689-700.

［7］ LASOTA J, DANSONKA-MIESZKOWSKA A, SOBIN L H, et al. A great majority of GISTs with PDGFRA mutations represent gastric tumors of low or no malignant potential［J］.Lab Invest, 2004, 84(7): 874-883.

［8］ 侯亞超, 鄧靖宇, 梁 寒. 基因檢測在胃腸間質瘤診療中的應用［J］. 中華胃腸外科雜志, 2015, 18(4): 305-308.

［9］ JIANG J, HUI C. Hedgehog signaling in development and cancer［J］. Dev Cell, 2008, 15(6): 801-812.

［10］ ARDEN K C. Multiple roles of FOXO transcription factors in mammalian cells point to multiple roles in cancer［J］. Exp Gerontol, 2006, 41(8): 709-717.