血清TLR-4在復蘇后肺損傷中的表達與機械通氣影響＊

毛洪濤，黃 亮，曹春水，熊華威，劉 勇

(南昌大學第一附屬醫院急診科，南昌 330006)

復蘇后綜合征（PRS）是指心搏突然驟停時機體由于嚴重缺氧、缺血、酸中毒或實施心肺復蘇（CPR）后體內大量釋放多種炎癥因子及自由基，導致各種有害物質進入機體組織細胞內，引發的機體組織細胞彌漫性損傷，進而出現機體多器官功能障礙綜合征（MODS）[1]。肺由于其結構和功能的特殊性，是復蘇后較容易損傷的臟器之一。TLR-4是Toll樣受體家族中的一類，是固有免疫和適應免疫極為重要的天然免疫抗體，在介導中性粒細胞活化及TNF-α肺內的聚集、引起肺內產生大量的活性氧自由基（ROS）導致的損傷中起至關重要的作用[2]。為改善肺功能、減少肺損傷并改善心腦等重要器官氧供，機械通氣是最佳治療手段，但隨著研究的深入，人們發現不當的通氣策略造成的并發癥和呼吸機相關性肺損傷亦能給患者造成嚴重后果，機械通氣策略的選擇將影響患者預后。本研究通過檢測復蘇后綜合征患者在不同潮氣量及呼氣末正壓(PEEP)機械通氣條件下氧合指數（OI）、急性肺損傷評分（LIS）、血清TLR-4水平，探討心肺復蘇后的合理機械通氣方式。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2013年1月-2016年1月收治的心搏驟停后復蘇后綜合征患者24例，其中呼吸衰竭6例 (25%)，急性心肌梗死5例(20.8%)，腦血管意外4例(16.6%)，有機磷中毒3例(12.5%)，窒息 3 例(12.5%)，休克 2 例(8.3%)，一氧化碳中毒1例(4.1%)。采用數字表法隨機分為A1、A2、A3、B1、B2、B3組，每組 4例。 A1組采用低潮氣量(6ml/kg)+低 PEEP〔3cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)〕，男3 例，女 1 例；年齡 45-66 歲，平均（52.3±8.2）歲。A2組采用低潮氣量(6ml/kg)+中等PEEP(6cmH2O)，男 2 例，女 2 例，年齡 47-59 歲，平均（53.3±5.9）歲。A3組采用低潮氣量 (6ml/kg)+高PEEP(12cmH2O)，男 3例，女 1例，年齡 48-61歲，平均（55.1±7.8）歲。 B1組采用常規潮氣量(10ml/kg)+低PEEP(3cmH2O)，男 2 例，女 2 例，年齡 50-65 歲，平均（57.7±7.3）歲。B2組采用常規潮氣量(10ml/kg)+中等 PEEP(6cmH2O)，男 2例，女 2例，年齡 48-69歲，平均（55.9±8.6）歲。B3組中采用常規潮氣量(10ml/kg)+高 PEEP(12cmH2O)，男 2 例，女 2 例，年齡50-67歲，平均（56.3±6.2）歲。各組患者的性別、年齡具有均衡性，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究方案經本院倫理委員會同意，并與研究患者委托人簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 入選患者入院時判斷為心搏驟停，立即進行心肺復蘇術，心室纖顫者先給予除顫，并立即按心肺復蘇指南要求行胸外按壓，采用經口氣管內插管術，插管成功后立即接呼吸機容量控制通氣，自主循環恢復(ROSC)前每3min靜脈注射腎上腺素1mg，ROSC后停止心肺復蘇術。

1.2.2 各組采用PB840型呼吸機進行機械通氣，選擇容量控制通氣模式，初始設計呼吸頻率為16次/min，吸入氧濃度(FiO2)為 40%，吸呼比為 1：2，潮氣量及PEEP按各組實驗要求設置。

1.2.3 觀察指標 ROSC后開始計時，觀察并記錄各組患者 1h、6h、12h、24h 時氧合指數(OI)、血氣分析、24h行床邊胸片，計算急性肺損傷評分（LIS）（見表1）。各時間點抽取各組患者外周靜脈血4ml，采用ELISA法檢測血清中TLR-4水平。

表1 LIS評分表

1.2.4 TLR-4檢測 外周靜脈血樣注入無菌真空采血管，3000r/min離心，取上層血清凍于-20℃冰箱備測。采用美國R&D公司生產試劑盒：Human TLR-4 ELISA Kit。嚴格按照試劑使用說明書進行操作。⑴準備：從冰箱取出試劑盒，室溫復溫30min；⑵配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液；⑶加標準品和待測樣本：取酶標包被板，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加標準品50μl；待測樣本孔中先加入待測樣本 10μl，再加樣本稀釋液40μl(即樣本稀釋5倍)；空白對照不加；⑷溫育：37℃水浴恒溫箱溫育30min；⑸洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，酶標洗板機洗板；⑹加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μl，空白對照孔不加；⑺溫育；⑻洗板；⑼顯色：每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，37℃避光顯色15min；⑽終止：取出酶標板，每孔加終止液 50μl，終止反應(顏色由藍變黃)；⑾測定：以空白孔調零，終止后15min內，用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)；⑿計算：根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣本濃度。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行數據統計與分析，計量資料以s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 OI組內各時間點比較，各組24h與1h、6h、12h相比，OI降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；組間各時間點比較，A2組24h與其他各組同時間點相比，OI升高，差異均有統計學意義（P＜0.05)。見表2。

表2 各組OI比較

表2 各組OI比較

注：與組內 24h 時比較，*P＜0.05；與 A2 組 24h 時比較，#P＜0.05。

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2.2 急性肺損傷評分（LIS）各組24h LIS分值為0.5-2.5 分，平均（1.5±1.0）分，A2 組與其他各組相比，LIS低于其他各組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。 見表 3。

表3 各組24h LIS比較

表3 各組24h LIS比較

注：A2 組與其他各組相比，★P＜0.05。

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2.3 TLR-4水平 各組血清TLR-4水平隨著時間延長均升高，組內比較，各組12h、24h較1h時間點TLR-4水平升高（P＜0.05）；與其他各組同時間點相比，A2組12h、24h時TLR-4水平低于其他各組（P＜0.05）。 見表 4。

3 討論

盡管目前心肺復蘇技術在不斷的提高和推廣，部分心臟驟停患者能夠恢復自主循環，但是自主循環建立后，機體往往會出現復蘇后綜合征，出現全身反應性的缺血再灌注，機體的神經、血管活性物質發生改變，產生大量的細胞因子、粘附因子等的變化，最后引發全身炎癥反應綜合征（SIRS)，出現多臟器功能障礙（MODS），最終導致病人的死亡[1]。肺臟是心肺復蘇中較易損傷的器官，機械通氣是治療復蘇后綜合征的重要手段，可迅速糾正缺氧，促進心、肺、腦功能的早期恢復[3]，在復蘇后綜合征患者治療中的支持作用最為關鍵，但是機械通氣在產生明顯益處的同時亦可能發生并發癥[4]，呼吸機相關肺損傷（VILI）是機械通氣常見的并發癥，可對復蘇后綜合征患者造成雙重打擊。近年來研究發現，機械通氣期間由肺牽張引起的機械轉導還可激活一系列細胞的信號通路，釋放炎癥因子，引起“生物傷”[5]。

表4 各組TLR-4水平（ng/ml）比較

表4 各組TLR-4水平（ng/ml）比較

注：與組內 1h 時比較，☆P＜0.05；與 A2 組對應時間點比較，△P＜0.05。

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急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）通常表現為頑固性低氧血癥，主要是由于肺內從右向左的分流，肺泡不張及肺泡腔水腫而引起通氣/換氣比例失調所致。氧合指數（OI）即動脈血氧分壓比吸氧濃度（PaO2/FiO2），簡便經濟，能較好地反映機體吸氧條件下的缺氧情況，且與肺內血液分流量呈密切相關，是早期發現ALI的有效指標。急性肺損傷評分（LIS）是1988年由Murray等提出的評價肺損傷嚴重程度的計分標準，可對肺損傷進行比較和半定量。

肺保護性通氣策略，即限制潮氣量(5-8ml/Kg）和平臺壓（＜30cmH2O），同時使用一定的PEEP維持肺泡的開放，減少肺“容積傷”、“剪切傷”的發生，最終降低肺“生物傷”的嚴重程度，降低急性呼吸窘迫綜合征的發生[6，7]。

本研究結果顯示，ROSC各組24h OI均明顯降低（P＜0.05），均低于 300，LIS 分值 0.5-2.5 分，表明心肺復蘇后24h呈現急性肺損傷改變；盡管肺損傷病因機制復雜，但A2組24h OI、LIS與其他各組相比，有統計學差異（P＜0.05)，提示設置低潮氣量(6ml/kg)配合中等PEEP(6cmH2O)有助于改善氧合，減輕肺損傷程度。

Toll樣受體（TLRs)分布廣泛，主要表達于單核細胞、巨噬細胞等細胞膜上，是一個天然免疫的家族，目前已經出克隆11種TLRs，TLR-4是Toll樣受體家族中的一類，其中TLR-4作為“門戶”蛋白啟動機體的炎癥鏈式反應，在跨膜信號轉導受體家族TLRs中占有重要的位置，目前關于TLR-4作為脂多糖受體介導細菌感染等炎癥反應已基本明確；在患者感染病原體后，血清中TLR-4表達量升高，隨著炎癥發展至膿毒癥時TLR-4表達量明顯升高[8]。有研究應用ELISA法檢測膿毒癥患者外周血清TLR-4濃度證實其表達水平與膿毒癥嚴重程度呈正相關[9]。但是研究也發現TLR-4在沒有脂多糖及細菌產物的情況下也同樣發揮著重要的作用，研究表明在缺血再灌注、創傷等損傷中，TLR-4可通過特殊的信號轉導通路，引起炎癥細胞活化而導致更多的損傷[10]。在缺血再灌注引起的肺部損傷最可能機制是肺泡巨噬細胞上的TLR-4與一些內源性配體如活性氧族、熱休克蛋白60、70等，及其他細胞外基質成分與TLR-4結合啟動炎癥反應，這些內源性配體可來自肺本身，也可來自全身組織缺血再灌注后隨著血液循環進入肺組織；未有脂多糖的情況下，TLR-4能夠介導缺血后明顯的肺損傷和腦損傷，引起TNF-α、ILs、NO等前炎癥因子的釋放，TNF-α 又可誘導 IL-1、IL-6、IL-8的生成，還可激活巨噬細胞、白細胞，促進血小板激活因子、NO、前列腺素和白細胞三烯等的產生，細胞因子相互作用引起的炎性介質過度釋放，產生炎性因子級聯放大反應，最終導致患者器官損害[11]。

本研究結果顯示，各組1h、6h時TLR-4水平差異無顯著性，A2組12h后TLR-4水平顯著低于其他各組。表明低潮氣量 （6ml/kg）+中等PEEP(6cmH2O)在12h后穩定內環境的作用優于其他通氣方式，提示機體內炎癥反應嚴重程度與呼吸機參數的設置相關；合理的機械通氣方式可將機械通氣對復蘇后綜合征患者的肺損傷炎癥反應降至最低，可能因為低潮氣量使肺的膨脹和牽拉相對較小，引起的損傷較少。但是較少的潮氣量可導致肺擴展受限，小氣道不張，如果時間較長，會導致肺微小不張，肺泡塌陷，呼吸死腔增加，分泌物不能排除，最終引起低氧血癥、肺部感染。為了避免不利影響，在使用小潮氣量通氣的同時加用中等PEEP，PEEP可使塌陷的支氣管和閉合的肺泡重新擴張，提高功能殘氣量及肺部順應性，改善通氣和氧合，且能夠減少肺內分流，但高PEEP也可引起病人低血壓或者其他不良反應。因此臨床應用中需選擇合理PEEP，低潮氣量（6ml/kg）+中等PEEP(6cmH2O)可降低機體的炎癥反應，減輕患者的肺損傷。

綜上所述，本研究初步說明，心肺復蘇后血清TLR-4表達升高并呈現肺損傷表現，低潮氣量（6ml/kg）+中等 PEEP（6cmH2O）可能是心肺復蘇后24h內較為合理的機械通氣方式。

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